2.2.1. Thu thập mẫu
Mẫu nƣớc nhiễm dầu đƣợc lấy tại Công ty xăng dầu B12 và dọc bờ biển cột 5 tới cột 8 TP. Hạ Long – Quảng Ninh; tại một số vùng ven biển Đồ Sơn, Hải Phòng; tại khu công nghiệp Nghi Sơn, Thanh Hóa, mẫu đƣợc lấy ở 2 vị trí: tầng nƣớc mặt và tầng bùn đáy. Mẫu lấy về đƣợc phân tích ngay trong vòng 24h lấy mẫu và đƣợc bảo quản ở tủ lạnh 4oC tại phòng Công nghệ sinh học môi trƣờng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH
Làm giàu vi sinh vật
- Nguyên tắc:Tạo môi trƣờng thích hợp làm gia tăng số lƣợng vsv từ mẫu
thu thập ban đầu trên nguồn cơ chất quan tâm.
- Tiến hành:Hút 10 ml đối với mẫu nƣớc và 3g đối với mẫu bùn vào bình
tam giác thể tích 250 ml có chứa 50 ml môi trƣờng muối khoáng Gost dịch, 0,1% vitamin, 50 ppm hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene) và 1 bình có bổ sung thêm 0,5% glucose. Nuôi lắc các bình ở 200 vòng/phút, ở 30oC, sau 7 ngày nuôi, chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình nuôi cấy thứ 2 chứa các thành phần giống nhƣ ở lần làm giàu thứ nhất, quá trình nuôi cấy làm giàu đƣợc tiến hành 3 lần.
29
Phƣơng pháp pha loãng tới hạn
- Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng
rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật.
- Tiến hành: Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc
cất, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1, hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất ta sẽ đƣợc độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục nhƣ vậy đến nồng độ 10-8.
Tìm kiếm tập đoàn vsv và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử PAH đƣợc tuyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Nguyên tắc:
Thu đƣợc tập đoàn vsv có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH. Từ đó tách rời các tế bào vsv dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc để thu các chủng thuần.
Tiến hành:
- Môi trƣờng Gost sau khi khử trùng để nguội tới khoảng 50 - 60oC, tiến hành đổ vào các đĩa petri (đã tiệt trùng) trong box cấy vô trùng. Mỗi đĩa đổ khoảng 20 ml môi trƣờng.
- Sau khi thạch đông (đĩa khô), hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng tới hạn ở nồng độ 10-4, 10-6, 10-8 vào các đĩa thạch này, Gạt kiểm tra các mẫu sau khi làm giàu lần 1, lần 2 và lần 3.
- Dùng que trang trải đều mẫu khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que này để trải đều khắp bề mặt thạch ở đĩa thứ 2, thứ 3.
- Các đĩa sau khi cấy gạt đƣợc bao gói cẩn thận và nuôi ở tủ ấm 30oC cho tới khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ.
30
2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng có chứa cơ chất PAH.
Nguyên lý:
Khi nuôi vsv trong môi trƣờng muối khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene), vsv sẽ sử dụng PAH nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Sự phát triển của vsv đƣợc đánh giá định tính thông qua sự thay đổi độ đục của môi trƣờng nuôi cấy và lƣợng sinh khối bám trên thành bình.
Tiến hành:
- Nuôi qua đêm vsv trong môi trƣờng HKTS dịch để làm tƣơi mới chủng, ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối hai lần bằng nƣớc cất, hòa tan sinh khối, đo OD dịch sinh khối ở bƣớc sóng 600 nm, tính lƣợng sinh khối đầu vào cho 20 ml môi trƣờng bằng 0,3 khi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để khảo sát khả năng sử dụng PAH của chủng vi khuẩn.
- Bổ sung dịch sinh khối đã tính toán của mỗi chủng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có chứa 20 ml Gost dịch, 0,1% vitamin, 50ppm PAH. Đem nuôi ở tủ lắc 30oC, ở 200 vòng/phút và quan sát sự thay đổi màu, lƣợng sinh khối bám trên thành bình trong quá trình nuôi khoảng 7 đến 9 ngày. Đo OD tại bƣớc sóng 600nm theo từng ngày để theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của chủng vi sinh vật trong môi trƣờng có chứa PAH.
- Chọn những chủng có khả năng phát triển tốt nhất ở nồng độ 50ppm để tiến hành nuôi ở điều kiện môi trƣờng có chứa nồng độ PAH cao hơn nhằm tìm kiếm những chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất.
2.2.4. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Tiến hành theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006). [33, 35]
Làm tƣơi mới chủng tạo biofilm:
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MPA dịch. Sau 14 - 16 h nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4.000 rpm, 4oC trong
31
vòng 10 phút và rửa nƣớc cất 2 lần với thể tích tƣơng ứng). Bổ sung nƣớc cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nƣớc cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl môi trƣờng MPA. Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu đƣợc nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h.
Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch axít acetic 33% sau nhuộm có tác dụng loại bỏ tím tinh thể ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, lúc này các tím tinh thể sẽ đƣợc giải phóng và hòa tan trong dung môi. Giá trị OD ở bƣớc sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lƣợng tím tinh thể đƣợc cố định, tức đặc trƣng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay nói cách là khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn tƣơng ứng.
Tiến hành:
Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tƣơng ứng với 3 eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các bƣớc sau:
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy ra 1 cách nhẹ nhàng (không làm vỡ màng) - Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nƣớc cất. Quá trình này đƣợc lặp lại 2 lần.
- Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf ở nhiệt độ phòng
- Đợi 10 phút để cố định màng - Hút bỏ dung dịch tím tinh thể - Rửa bằng 500 μl nƣớc cất, 2 lần
- Bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33%
32
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng nhƣ loại PAH đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn loại PAH đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
- Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ: Tiến hành nhƣ mục 2.2.3 ở các nhiệt độ 20 oC, 28 oC, 30 oC, 37 oC,45oC
- Khảo sát ảnh hƣởng của pH: Chuẩn bị môi trƣờng Gost với các dải pH, sử dụng dải pH: 6, 7, 8, 9, 10. Sử dụng hỗn hợp 50 ppm PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene). Tiến hành nhƣ mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hƣởng của muối NaCl: Chuẩn bị môi trƣờng Gost có bổ sung các nồng độ NaCl khác nhau: 0 %, 1%, 1,5 %, 2 % và tiến hành nhƣ mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ và loại PAH khác nhau: tiến hành nhƣ mục 2.2.3 nhƣng sử dụng các PAH ở các nồng độ khác nhau
2.2.6. Đánh giá khả năng phân hủy PAH của màng sinh học (biofilm) do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành
2.2.6.1. Quy trình tạo biofilm đa chủng
Bƣớc 1: Từ các chủng vi khuẩn lựa chọn sinh khối của chúng đƣợc nhân lên trong 50 ml môi trƣờng LB dịch trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 30 oC trong 24 giờ.
Bƣớc 2: Sau 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/4 oC trong 10 phút để thu sinh khối. Rửa bằng nƣớc cất 2 lần.
Bƣớc 3: Hòa tan sinh khối bằng nƣớc cất, đo OD ở bƣớc song 600nm và tính toán sao cho OD600 = 0,3. Bổ sung 4,5 lít môi trƣờng LB dịch vào bình trụ thủy tinh.
Bƣớc 4: Để tĩnh trong 24 giờ sao cho trên bề mặt bình thủy tinh xuất hiện lớp màng vi sinh vật.
Bƣớc 5: Dùng pipet hút nhẹ dịch ở dƣới màng và rửa sạch màng bằng nƣớc cất 2 lần.
Bƣớc 6: Bổ sung 5 lít Gost dịch, bổ sung 0,5% glucose; 0,1% vitamin tùy vào mục đích xử lý mà bổ sung nguồn cơ chất thích hợp nhƣ: dầu FO,nƣớc thải ô
33
nhiễm dầu hoặc các loại PAH. Bƣớc 7: Nuôi tĩnh 9-14 ngày mang mẫu đi phân tích để đánh giá hiệu quả xử lý các thành phần trên.
2.2.6.2. Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocacbon thơm bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ.
Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích PAH trong nƣớc trên cơ sở phƣơng pháp US EPA method 610
- Lấy 60 ml CH2Cl2 cho vào 500ml mẫu nƣớc đựng trong phễu chiết, lắc đều, để lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH2Cl2 (bên dƣới) ra.
- Tiếp tục thêm 60 ml CH2Cl2 vào pha nƣớc, làm tƣơng tự nhƣ trên. (chiết 3 lần)
- Gom toàn bộ dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4, lọc, cô quay dung môi dƣới áp suất giảm đến khi còn 10 ml.
- Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan - Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0.2µl mẫu vào máy GC/MS
Máy phân tích thuộc hệ GC/MS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS. Chƣơng trình nhiệt độ 50 - (3/ph) - 80- (8/ph) - 200 (15/ph) - 250 (7ph).
Nguyên lý hoạt động của máy GC-MS:
Các Mẫu đƣợc đƣợc bơm vào cổng bơm sau đó đƣợc đƣa đến buồng hoá khí (Mẫu lỏng hoá thành dạng khí dƣới áp suất thấp (10-4
– 10-7mmHg) nhờ bơm hút chân không. Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thƣờng đứng yên(chất tẩm bên trong cột), có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh(khí mang, Helium) gọi là pha động. do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần lƣợt đi vào buồng ion hóa qua một lỗ nhỏ có đƣờng kính 0,013 – 0,05mm (bằng vàng), dòng phân tử khí của mẫu va chạm với dòng electron mang năng lƣợng cao làm các phân tử mẫu trung hoà bị bật ra các electron và phá vỡ phân tử thành các
34
mảnh ion dƣơng, mảnh gốc hay phân tử trung hoà nhỏ. Các mảnh ion hình thành có khối lƣợng m và điện tích e. sau đó chúng đƣợc gia tốc ở trong ống tứ cực và chuyển động đến va đập vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuyếch đại rồi chuyển sang bộ ghi. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả. Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là pic. Thời gian lƣu của pic là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách.Còn diện tích pic là thƣớc đo định lƣợng cho chất cần phân tích.
35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH môi trƣờng chứa PAH
Phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm có thể diễn ra theo hai cơ chế đồng trao đổi chất và cơ chế sử dụng các hợp chất vòng thơm là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất. Ở cơ chế đồng trao đổi chất việc bổ sung nguồn carbon dễ hấp thụ đối với vi sinh vật giúp sẽ chúng sinh trƣởng, phát triển tốt đồng thời tăng khả năng phân hủy sinh học của các hợp chất vòng thơm. [19]
Trong nghiên cứu này từ mẫu ban đầu đƣợc lấy từ các vị trí ô nhiễm dầu, để làm gia tăng số lƣợng vi sinh vật sử dụng các hợp chất vòng thơm, chúng tôi tiến hành làm giàu mẫu trên môi trƣờng muối khoáng Gost có bổ sung 0,1% vitamin và 50ppm PAH, không có và có glucose với nồng độ là 0,5%.
Sau 3 lần làm giàu, chúng tôi nhận thấy màu sắc và độ đục của môi trƣờng thay đổi rõ rệt so với nguồn mẫu nƣớc thải ban đầu. So với lần làm giàu thứ nhất, lần làm giàu thứ 2 và thứ 3 chúng tôi quan sát thấy sau 24h nuôi lắc, màu môi trƣờng thay đổi rõ rệt và sinh khối ngày càng tăng lên điều đó cho thấy phần nào sự phát triển nhanh chóng của các vi sinh vật trong mẫu nƣớc thải. Dịch làm giàu có bổ sung glucose có độ đục dịch nuôi cũng nhƣ sinh khối bám trên thành bình nhiều hơn so với các dịch làm giàu không bổ sung glucose tƣơng ứng (Hình 3.1).
Mẫu ban đầu Lần 1 Lần 2 Lần 3
36
Mẫu ban đầu Lần 1 Lần 2 Lần 3
(B)
Hình 3. 1. Mẫu làm giàu vsv trên nguồn cơ chất PAH (A), hỗn hợp PAH và
glucose(B)
Từ các mẫu làm giàu lần 3, chúng tôi đã tiến hành pha loãng tới hạn và cấy gạt trên môi trƣờng Gost có chứa PAH sau 24 giờ chúng tôi thu đƣợc tập đoàn vi sinh vật, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
(A)
(B)
Hình 3. 2. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng Gost và PAH: không chứa
glucose (A), có chứa glucose (B).
Chúng tôi nhận thấy rằng tập đoàn vi sinh vật ở những bình làm giàu có chứa glucose đa dạng về chủng loại và số lƣợng hơn ở những bình không chứa glucose,
37
qua đó chúng tôi phần nào khẳng định đƣợc các chủng vi sinh vật này đã sử dụng PAH theo cơ chế đồng trao đổi chất. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc cân đối các nguồn dinh dƣỡng để hiệu quả xử lý là tốt nhất. Sau khi tiến hành tách riêng, làm sạch và quan sát đặc điểm khuẩn lạc, có 24 chủng vi khuẩn đã đƣợc phân lập.
Để tuyển chọn đƣợc các chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất trong các chủng trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng PAH của từng chủng trên môi trƣờng muối khoáng Gost dịch (20 ml) có bổ sung 50 ppm hỗn hợp PAH, 0,5% glucose 0,1% vitamin, nuôi lắc ở điều kiện 30oC trong 7 ngày. Khả năng sử dụng PAH đƣợc đánh giá định tính thông qua độ đục của môi trƣờng và lƣợng sinh khối bám trên thành bình. Kết quả sàng lọc đã nhận đƣợc 10 chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH mạnh nhất (Bảng 3.1).
Bảng 3. 1: Hình thái khuẩn lạc của 10 chủng vi khuẩn đã sàng lọc đƣợc.
TT Kí hiệu
chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
1 B2 Khuẩn lạc màu trắng trong, khi già có màu vàng nghệ, nhăn mép, có nhân ở giữa màu nâu khi còn non d-2mm 2 B5 Khuẩn lạc mầu hồng tròn dẹt, to, có nhân ở giữa, ăn sâu
vào thạch d-3mm