Tiến hành theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006). [33, 35]
Làm tƣơi mới chủng tạo biofilm:
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MPA dịch. Sau 14 - 16 h nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4.000 rpm, 4oC trong
31
vòng 10 phút và rửa nƣớc cất 2 lần với thể tích tƣơng ứng). Bổ sung nƣớc cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nƣớc cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl môi trƣờng MPA. Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu đƣợc nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h.
Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch axít acetic 33% sau nhuộm có tác dụng loại bỏ tím tinh thể ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, lúc này các tím tinh thể sẽ đƣợc giải phóng và hòa tan trong dung môi. Giá trị OD ở bƣớc sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lƣợng tím tinh thể đƣợc cố định, tức đặc trƣng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay nói cách là khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn tƣơng ứng.
Tiến hành:
Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tƣơng ứng với 3 eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các bƣớc sau:
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy ra 1 cách nhẹ nhàng (không làm vỡ màng) - Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nƣớc cất. Quá trình này đƣợc lặp lại 2 lần.
- Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf ở nhiệt độ phòng
- Đợi 10 phút để cố định màng - Hút bỏ dung dịch tím tinh thể - Rửa bằng 500 μl nƣớc cất, 2 lần
- Bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33%
32