Phân tích định lượng forskolin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ vết (TLCS - Thin layer chromatogams scanning)
Chuẩn bị mẫu :
- Mẫu thử: Cân 1,0 g dược liệu đã xay nhỏ, chiết với 20ml methanol
x 2 lần, siêu âm 30 phút mỗi lần. Gạn, gộp dịch chiết vào cốc có mỏ, làm
bay hơi dung môi trên cách thuỷ đến cạn. Hoà cắn thu được trong 1 ml methanol và 9ml nước, cho vào bình lắng gạn, lắc với 20ml x 3 lần chloroform. Gạn, gộp phần chloroform vào cốc có mỏ, bốc hơi thành cắn. Hòa cắn thu được vừa đủ 10ml methanol, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, bỏ 1ml dịch lọc đầu, lấy 1- 2ml dịch lọc tiếp theo để chấm sắc ký.
- Mẫu đối chiếu: Dung dịch forskolin 0,2mg/ml trong methanol.
Lớp mỏng: HPTLC Silica gel 60 F254 Merck.
Chấm mẫu: Chấm thang chuẩn: 2µl, 4µl x 2, 6µl x 2, 8µl và 10µl; Mẫu thử: 10 - 12µl.
Hệ dung môi sắc ký:
n.Hexan: ethylacetat (2 : 1), để bình sắc ký bão hoà dung môi 20 phút.
Cách tiến hành: Kính sau khi đã triển khai với hệ dung môi nêu trên, cao 85mm, lấy ra, để bay hơi hết dung môi trong hốt, thời gian 30 phút. Tiến hành đo TLC scanning trên máy CAMAG.TLC. SCANNER3.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Phát hiện: Chế độ đo hấp thụ λ 220 nm. Các điều kiện và thông số
áp dụng đo trên máy CAMAG TLC SCANNER 3 đều được đặt ở mức thông thường theo qui định, tốc độ quét 20mm/s, đo remission, đặt các thông số đo: khoảng cách đo chiều X 15mm, chiều Y (8mm), chiều rộng band (8mm), khoảng cách giữa các band (10mm), integration limits 10 - 80mm, chọn bước sóng đo và nguồn sáng tùy thuộc vào từng trường hợp cụ
thể để áp dụng, số lượng vết đo (tối đa 18 vết). Thực hiện chương trình đo theo phần mềm Wintcats, đọc kết quảđo và tính kết quảđịnh lượng:
m.V.100.100 X% =
υ.1000. P (100 – B) Trong đó :
X% : Hàm lượng % hoạt chất trong dược liệu khô tuyệt đối
m : Lượng mẫu thửđo được (µg) (kết quả trung bình của 2-3 lần nhắc lại)
υ : Lượng mẫu thử chấm trên máy (µl) V: Thể tích dịch chiết mẫu thử (ml) P : Khối lượng dược liệu đem cân (g) B : Độẩm của dược liệu
e. Tính hiệu quả kinh tếPhương pháp lấy mẫu