3.2.3.1. Chuẩn bị môi trường và dung dịch pha loãng
Xem mục 2.2.4
3.2.3.2. Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn:
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
-Staphylococcus aureus ATCC 6538
-Streptococcus mutans ATCC 700610
-Streptococcus sanguinis ATCC 10556 Vi nấm:
-Candida albicans ATCC 10231
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật gốc:
Tăng sinh các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng thạch casein đậu tƣơng vô khuẩn, ủ ở 32 đến 35oC trong 24 h. Đối với vi nấm, tăng sinh trên môi trƣờng thạch Sabouraud, ủ ở 20 đến 25oC trong 48 h.
Sau thời gian ủ, cho vào mỗi ống môi trƣờng 5 ml nƣớc muối sinh lý vô khuẩn, rửa bề mặt thạch, tập trung dịch rửa vào một bình chứa vô khuẩn. Pha loãng dung dịch chủng thu đƣợc bằng nƣớc muối sinh lý và so sánh với độ đục chuẩn McFarland số 2 để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật gốc có nồng độ khoảng 6×108
CFU/ml. Hỗn dịch gốc này đƣợc bảo quản từ 2 – 8 ºC và sử dụng trong vòng 24 h sau khi gặt.
- 54 -
Đếm số lƣợng tế bào sống của mỗi hỗn dịch vi sinh vật gốc bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả trong chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV).
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật làm việc:
Dựa vào kết quả đếm số lƣợng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc, dùng dung dịch nƣớc muối sinh lý pha loãng hỗn dịch gốc để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật làm việc có nồng độ vi sinh vật từ 107 đến 108 CFU/ml.
3.2.3.3. Tiến hành
Hút 10 ml chế phẩm vào một ống nghiệm vô trùng. Cấy vào mỗi ống nghiệm hỗn dịch làm việc của một loại vi sinh vật thử nghiệm, trộn đều. Thể tích hỗn dịch chủng vi sinh vật làm việc chiếm 1,0 % thể tích mẫu.
Xác định số lƣợng vi sinh vật ở thời điểm 30 giây sau khi vi sinh vật tiếp xúc với mẫu bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả ở chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV).
Song song xác định lại số lƣợng vi sinh vật trong hỗn dịch vi sinh vật làm việc bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ đối với mẫu thử.
- 55 -
3.2.3.4. Kết quả
Thử giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu:
Bảng 3.17. Giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu
Nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Dung dịch AgNO3 trong nền nước súc miệng Vi khuẩn hiếu khí Vi nấm Vi khuẩn hiếu khí Vi nấm Đĩa 1 0 0 0 0 Đĩa 2 0 0 0 0
Kết quả < 1CFU/ml < 1 CFU/ml < 1 CFU/ml < 1CFU/ml
Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc:
Bảng 3.18. Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc
Chủng
Nồng độ pha loãng Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc (CFU/ml) 10-5 10-6 10-7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Nhiều Nhiều 268 271 × 107 Nhiều Nhiều 273 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Nhiều Nhiều 163 160 × 107 Nhiều Nhiều 157 Streptococcus mutans ATCC 700610 Nhiều Nhiều 35 39 × 107 Nhiều Nhiều 42 Streptococcus sanguinis ATCC 10556 Nhiều 105 9 102 × 106 Nhiều 98 9 Candida albicans ATCC 10231 Nhiều 32 3 31 × 106 Nhiều 29 4
- 56 -
Pha loãng hỗn dịch gốc bằng NaCl 0,9% để thu được hỗn dịch làm việc: Bảng 3.19. Pha chế hỗn dịch làm việc Chủng Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc (CFU/ml) Thể tích hỗn dịch gốc Thể tích NaCl 0,9% Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch làm việc (CFU/ml) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 271 × 107 0,8 ml 99,2 ml 2 × 107 Staphylococcus aureus ATCC 6538 160 × 107 1,3 ml 98,7 ml 2 × 107 Streptococcus mutans ATCC 700610 39 × 107 5,4 ml 94,6 ml 2 ×107 Streptococcus sanguinis ATCC 10556 102 × 106 2,0 ml 8,0 ml 2 × 107 Candida albicans ATCC 10231 31 × 106 7,0 ml 3,0 ml 2 × 107 CFU/ml
Số lượng vi sinh vật sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử:
Bảng 3.20. Số lượng vi sinh vật sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử
Chủng VSV
Số lượng VSV sau khi tiếp xúc 30 giây
với mẫu thử Số lượng VSV
trong hỗn dịch chủng làm việc (CFU/đĩa) Dung dịch nano bạc 5 ppm (CFU/đĩa) Dung dịch AgNO3 5ppm trong nền nước súc miệng (CFU/đĩa) Dung dịch gốc 10-1 10-2 10-3 Dung dịch gốc 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 223 21 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 248 24 Staphylococcus aureus ATCC 6538 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 273 23 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 248 20 Streptococcus mutans ATCC 700610 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 172 16 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 189 14 Streptococcus sanguinis ATCC 10556 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 195 21 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 211 26 Candida albicans ATCC 10231 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 231 22 0 0 0 0 0 0 0 0 Nhiều 242 19
- 57 -
Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử:
Bảng 3.21. Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử
Chủng vi sinh vật
Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử
Dung dịch Nano bạc 5 ppm
Dung dịch AgNO3 5ppm trong nền nước súc miệng
Staphylococcus aureus ATCC 6538 100,0% 100,0% Streptococcus sanguinis ATCC 10556 100,0% 100,0% Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 100,0% 100,0% Streptococcus mutans ATCC 700610 100,0% 100,0% Candida albicans ATCC 10231 100,0% 100,0%
3.2.3.5. Dự kiến chỉ tiêu về tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Từ kết quả trên có thể đƣa ra dự kiến chỉ tiêu về tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm nhƣ sau:
- Sử dụng phƣơng pháp tiếp xúc để đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm. Xác định số lƣợng vi sinh vật ở thời điểm bắt đầu thử nghiệm (R0) và thời điểm sau 30 giây tiếp xúc với chế phẩm (Rt). Tính phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc.
- Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc với mẫu thử phải không dƣới 99,95%.
- 58 -
3.2.4. Dự thảo một số chỉ tiêu kiểm ngiệm đối với các sản phẩm nghiên cứu
3.2.4.1. Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
Bảng 3.22. Dự thảo một số chỉ tiêu kiểm nghiệm đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
TT Chỉ tiêu Phƣơng pháp thử Yêu cầu
1 Tính chất Cảm quan Hỗn dịch trong, màu vàng đậm.
2 Hình dạng và kích thƣớc các tiểu phân bạc Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn nhất phải dƣới 100nm. - Tỷ lệ các tiểu phân bạc có kích thƣớc 30-40nm phải không dƣới 90%.
- Tỷ lệ các tiểu phân bạc có hình cầu phải đạt trên 90%.
3 Định tính
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên
tử
Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ tại vạch phát xạ đặc trƣng của nguyên tố Bạc ở bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn 4 Định lƣợng Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Hàm lƣợng bạc trong chế phẩm phải đạt từ 95 đến 105% so với lƣợng ghi trên nhãn
- 59 -
3.2.4.2. Dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Bảng 3.23. Dự thảo một số chỉ tiêu kiểm nghiệm đối với dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
TT Chỉ tiêu Phƣơng pháp thử Yêu cầu
1 Tính chất Cảm quan Dung dịch trong, màu xanh dƣơng. 2 Hình dạng và kích thƣớc các tiểu phân bạc Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn nhất phải dƣới 100nm. - Tỷ lệ các tiểu phân bạc có kích thƣớc 30-40nm phải không dƣới 90%.
- Tỷ lệ các tiểu phân bạc có hình cầu phải đạt trên 90%.
3 Định tính
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên
tử
Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ tại vạch phát xạ đặc trƣng của nguyên tố Bạc ở bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn. 4 Định lƣợng Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Hàm lƣợng bạc trong chế phẩm phải đạt từ 90 đến 110% so với lƣợng ghi trên nhãn. 5 Tác dụng diệt
khuẩn Phƣơng pháp tiếp xúc
Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc với mẫu thử phải không dƣới 99,95%.
- 60 -
Chƣơng 4
BÀN LUẬN
4.1. VỀ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG BẠC BẰNG AAS
Định tính và định lƣợng bạc bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa đèn khí.
Đây là phƣơng pháp phân tích có độ chính xác cao, độ lặp lại rất tốt và độ nhạy cao nên rất thích hợp để phân tích các chế phẩm chứa bạc ở dạng nano. Bạc là nguyên tố dễ hòa tan trong dung dịch acid nitric để tạo thành muối bạc nitrat, acid nitric là hóa chất sẵn có ở các phòng thí nghiệm, việc xử lý mẫu cũng tƣơng đối đơn giản khi dùng acid nitric 1% làm môi trƣờng hòa tan. Sử dụng acid nitric nồng độ thấp sẽ hạn chế sự bay hơi, độc hại và đồng thời nồng độ acid càng bé sẽ giảm ảnh hƣởng hóa học của phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Phƣơng pháp này cho độ nhạy cao, định lƣợng các nguyên tố ở dạng vết, chính vì vậy trƣớc mỗi lần khảo sát hay đo độ hấp thụ của các mẫu thử, mẫu chuẩn khoảng tuyến tính đều đƣợc xác định, nhằm tránh hiện tƣợng sai số điểm. Và trƣớc khi tiến hành pha các dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, cần cho dung dịch acid nitric 10% tinh khiết AAS vào các bình sẽ pha mẫu, lắc sau đó ngâm 30 phút, rồi tráng lại bằng nƣớc trao đổi ion 3 lần.
Phƣơng pháp đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn của ASEAN, AOAC và các tài liệu chuyên ngành của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại. Các kết quả thu đƣợc đạt yêu cầu và đảm bảo cho việc phân tích bạc một cách chính xác trong các chế phẩm nghiên cứu. Tuy nhiên, phƣơng pháp đánh giá độ đúng đối với mẫu hỗn dịch bằng cách chuẩn bị mẫu tự tạo chƣa thật sự phù hợp, nhƣng do trên thị trƣờng không có mẫu hỗn dịch nano bạc chuẩn nên việc sử dụng các phƣơng pháp nhƣ thêm chuẩn gặp khó khăn. Vì vậy, phƣơng pháp chuẩn bị mẫu tự tạo đã đƣợc sử dụng để tiến hành khảo sát độ đúng đối với mẫu hỗn dịch.
Chỉ tiêu định tính và định lƣợng bằng quang phổ AAS rất quan trọng trong việc xác định sự có mặt của bạc và hàm lƣợng bạc tổng (bạc ở dƣới dạng ion và
- 61 -
dạng nguyên tử) có trong các chế phẩm. Một số nghiên cứu về xây dựng tiêu chuẩn cho nh ng sản phẩm tƣơng tự nhƣ: gel rửa tay nano bạc cũng đƣa ra chỉ tiêu này [18]. Tuy nhiên, phƣơng pháp AAS để định lƣợng Ag không đảm bảo tính đặc hiệu vì không phân biệt đƣợc lƣợng Ag0
và Ag+. Vì vậy, để xác định đƣợc hàm lƣợng bạc ở dạng nano (bạc nguyên tử) thì cần có chỉ tiêu xác định lƣợng ion bạc dƣ trong chế phẩm.
4.2. VỀ XÁC ĐỊNH HÌNH DẠNG VÀ KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN NANO BẠC Chỉ tiêu xác định hình dạng và kích thƣớc tiểu phân nano bạc là rất quan trọng đối với quá trình bào chế cũng nhƣ kiểm nghiệm. Điều này cho phép đánh giá quy trình bào chế đã đạt yêu cầu và chất lƣợng của chế phẩm đã thực sự đạt kích thƣớc nano hay chƣa. Phƣơng pháp sử dụng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu, độ phóng đại 20 – 800000 lần. Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực hiện bằng ghi nhận và phân tích bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Từ hình ảnh chụp đƣợc có thể xác định đƣợc kích thƣớc và hình dạng của các tiểu phân nano bạc.
Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rất nhiều trong khoa học vật liệu, trong luyện kim và trong sinh học. Với các tính năng nhƣ: quan sát bề mặt mẫu rắn ở các độ phóng đại khác nhau, độ sâu trƣờng quan sát lớn hơn rất nhiều so với kính hiển vi quang học, cho phép thu ảnh lập thể, kết hợp với đầu thu phổ tán xạ năng lƣợng tia X (EDX) cho phép phân tích thành phần nguyên tố của vùng quan sát. Một nhƣợc điểm của SEM là đôi khi hình ảnh còn chƣa sắc nét. Để tăng độ phân giải cho hình ảnh, khả năng quan sát rõ hơn thì ngƣời ta sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) sẽ cho kết quả tốt hơn, nhƣng thiết bị TEM đắt tiền hơn SEM nên còn chƣa đƣợc phổ biến.
Đề tài cũng đã áp dụng phƣơng pháp đánh giá kích thƣớc và hình dạng tiểu phân nano bạc bằng kính hiển vi điện tử quét để khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố trong quá trình bào chế tới hình dạng, kích thƣớc tiểu phân nano bạc bao gồm: Tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30, tốc độ khuấy dung dịch AgNO3, tốc độ bơm
- 62 -
NaBH4 để nhằm thiết lập đƣợc quy trình bào chế hỗn dịch nano bạc 1000 ppm ổn định về nồng độ, kích thƣớc, hình dạng của nano bạc.
Chỉ tiêu xác định hình dạng và kích thƣớc tiểu phân là rất quan trọng đối với một sản phẩm nano, nó cho biết các tiểu phân bạc đã đạt đƣợc kích thƣớc nano hay chƣa, từ đó ảnh hƣởng đến tác dụng diệt khuẩn của chế phẩm. Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để xác định hình dạng và kích thƣớc tiểu phân cho kết quả chân thực và chính xác về hình ảnh các tiểu phân. Tuy nhiên, việc sử dụng SEM gặp khó khăn bởi vì hiện nay các đơn vị kiểm nghiệm hầu nhƣ chƣa đƣợc trang bị. Một số kỹ thuật có thể xác định kích thƣớc hạt nano bạc nhƣng với độ chính xác kém hơn SEM nhƣ: quang phổ UV-VIS, tán xạ ánh sáng động (DLS).
4.3. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN
Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm đã đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp tiếp xúc. Phƣơng pháp này đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản, một chuyên luận ở Dƣợc điển Việt Nam IV. Tuy nhiên, chủng vi sinh vật, môi trƣờng nuôi cấy và cách đánh giá kết quả đã đƣợc điều chỉnh để cho phù hợp đối với chế phẩm nghiên cứu. Kết quả đánh giá cho thấy tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm và dung dịch AgNO3 5 ppm (trong nền nƣớc súc miệng) là tƣơng đƣơng. Tuy nhiên, bạc nitrat là hóa chất gây độc cho phổi, có thể gây độc cho màng nhày, da, mắt. Tiếp xúc kéo dài có thể làm tổn thƣơng cơ quan trong cơ thể. Tiếp xúc với mắt ở nồng độ thấp có thể gây ra kích ứng mắt. Tiếp xúc da nhiều lần sẽ làm viêm, phá hủy tế bào da. Còn nano bạc không có hại cho sức khỏe con ngƣời với liều lƣợng tƣơng đối cao. Vì vậy, việc sử dụng nano bạc để bào chế dung dịch nƣớc súc miệng thay cho bạc nitrat là hoàn toàn hợp lý.
Chỉ tiêu đánh giá tác dụng diệt đối với nƣớc súc miệng nano bạc cũng quan trọng trong việc xây dựng tiêu chuẩn cho chế phẩm. Chỉ tiêu này nhằm đánh giá về tính hiệu quả của chế phẩm. Tuy nhiên, để đƣa ra yêu cầu về mức độ diệt khuẩn một cách chính xác hơn thì cần khảo sát ở trên cỡ mẫu lớn hơn và và trên nhiều nền mẫu khác nhau.
- 63 -
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua thực nghiệm, đề tài đã đạt đƣợc mục tiêu đề ra và có các kết luận nhƣ sau:
1. Đã xây dựng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử để định tính và định lƣợng bạc trong hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm. Cách chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn nhanh chóng, đơn giản, sử dụng dung dịch acid nitric 1% làm dung môi pha mẫu. Điều kiện đo nhƣ sau:
- Đèn cathod rỗng Ag.