Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn
Hút chính xác 5,0 ml dung dịch bạc chuẩn gốc 1000 ppm vào bình định mức 100,0 ml. Thêm dung dịch acid nitric 1,0% đến vừa đủ, lắc đều, thu đƣợc dung dịch bạc chuẩn 50 ppm. Hút chính xác nh ng thể tích dung dịch bạc chuẩn 50 ppm vào các bình định mức và pha loãng bằng dung dịch acid nitric 1% đến vừa đủ để thu đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ bạc là 0,5 ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 4,0 ppm và 5,0 ppm.
Chuẩn bị các dung dịch thử
- Đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm: Hút chính xác 5,0 ml hỗn dịch nano bạc 1000 ppm vào bình định mức 100,0 ml. Thêm 10 ml dung dịch acid nitric 10% lắc đều, đun cách thủy 10 phút, để nguội, thêm nƣớc trao đổi ion vừa đủ đến vạch thu đƣợc dung dịch bạc cỡ 50 ppm. Pha loãng bằng dung dịch acid nitric 1% để đƣợc dung dịch có nồng độ bạc cỡ 2,0 ppm.
- Đối với dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm: Hút chính xác 10,0 ml dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm vào bình định mức 25,0 ml, thêm 2,5 ml dung dịch HNO3 10%, đun cách thủy 30 phút, để nguội, thêm nƣớc trao đổi ion vừa đủ để thu đƣợc dung dịch bạc cỡ 2 ppm.
- 43 -
Cách đo
- Khởi động hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử. - Mở đƣờng nƣớc, mở van khí.
- Bật đèn, để ổn định đèn 15 phút. - Bật ngọn lửa.
- Khi tín hiệu đƣờng nền đã ổn định, tiến hành đo các dung dịch chuẩn, từ nồng độ thấp tới nồng độ cao, đo các dung dịch thử theo các thông số đƣa ra trong mục khảo sát các điều kiện đo. Dựng đƣờng chuẩn thực nghiệm biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ và nồng độ bạc trong dãy chuẩn. Nồng độ bạc trong dung dịch thử đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn.
Cách tính toán kết quả
Hàm lƣợng (%) bạc so với lƣợng ghi trên nhãn đƣợc tính theo công thức: C × f
X (%) = × 100 V × A
trong đó: C: Nồng độ của chế phẩm suy ra từ đƣờng chuẩn (ppm). f: Hệ số pha loãng mẫu thử.
V: Thể tích mẫu thử đem pha loãng (ml). A: Nồng độ trên nhãn của chế phẩm (ppm).
3.2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích bạc bằng AAS
Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm 6 lần theo các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống Lần đo Cường độ hấp thụ 1 0,0718 2 0,0713 3 0,0715 4 0,0717 5 0,0720
- 44 -
6 0,0720
Trung bình 0,0717
RSD (%) 0,39%
Kết quả thu đƣợc cho thấy hệ thống có tính thích hợp tốt, đảm bảo cho việc định lƣợng bạc.
Độ đặc hiệu của phương pháp
Chuẩn bị các mẫu nền có thành phần tƣơng tự nhƣ các chế phẩm nhƣng không có bạc, cụ thể nhƣ sau: * Mẫu nền của hỗn dịch - Hỗn hợp nƣớc cất – ethanol 96º (50:50) 2000 ml - PVP 15 gam - NaNO3 2,36 gam - Nƣớc cất vừa đủ 3000 ml
* Mẫu nền của nước súc miệng
- Sorbitol 10 gam - Isopropyl alcol 20 gam - Natri Saccharin 5 gam - Natri clorid 5 gam - Xylitol 1 gam - Thymol 1 gam - Màu Brilliant Blue FCF vừa đủ - Hƣơng liệu vừa đủ - Ethanol 90º 60 ml
- Nƣớc RO vừa đủ 1000 ml.
Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch mẫu nền, dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử ở các điều kiện đã lựa chọn. Với các nền mẫu thu đƣợc kết quả nhƣ ở Hình 3.16 và 3.17. Với các mẫu thử thu đƣợc kết quả nhƣ ở Hình 3.18 và 3.19.
- 45 -
Hình 3.16. Độ hấp thụ của mẫu nền hỗn dịch nano bạc 1000 ppm theo thời gian
Hình 3.17. Độ hấp thụ của mẫu nền dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm theo thời gian
- 46 -
Hình 3.18. Độ hấp thụ của mẫu thử hỗn dịch nano bạc 1000 ppm (mẫu HD1)
- 47 -
Kết quả theo dõi độ hấp thụ của mẫu nền và mẫu thử tƣơng ứng trong một khoảng thời gian nhất định cho thấy:
- Đối với mẫu nền của cả hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm độ hấp thụ đều ổn định ở giá trị 0,00;
- Đối với mẫu thử của cả hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nƣớc súc miệng 5 ppm có độ hấp thụ duy trì khá ổn định ở mức 0,07-0,08.
Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao, có thể dùng để định tính và đảm bảo cho việc định lƣợng bạc.
Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy 6 dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric 1%: 0,5 ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 4,0 ppm và 5,0 ppm. Tiến hành đo độ hấp thụ theo các thông số đo đã khảo sát. Mối tƣơng quan gi a độ hấp thụ và nồng độ dung dịch chuẩn đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình và hệ số tƣơng quan hồi quy.
Kết quả thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.11 và Hình 3.20.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
STT Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ (Abs) 1 0,5 0,0177 2 1,0 0,0358 3 2,0 0,0717 4 3,0 0,1064 5 4,0 0,1415 6 5,0 0,1755
- 48 - y = 0,0351x + 0,0008 R² = 0,9999 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 5,0000 6,0000 A b s ppm 0,5000 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 5,0000
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa cường độ hấp thụ và nồng độ bạc
Với điều kiện đã lựa chọn, trong khoảng nồng độ đã khảo sát có mối tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ gi a độ hấp thụ với nồng độ bạc với hệ số tƣơng quan r là 0,9999. Phƣơng trình tuyến tính xác định đƣợc là: y = 0,0351x + 0,0008.
Độ lặp lại
Tiến hành phân tích ở mức nồng độ 100% với 6 mẫu thử độc lập của cùng một chế phẩm, tính toán hàm lƣợng Ag tìm đƣợc so với nhãn. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD (%). Kết quả thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.12 và 3.13.
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
STT Độ hấp thụ (Abs) Nồng độ Ag của dung dịch thử (µg/ml) Hàm lượng bạc tìm được so với nhãn (%) 1 0,0696 1,9601 98,01 2 0,0696 1,9601 98,01 3 0,0694 1,9544 97,72 4 0,0701 1,9744 98,72 5 0,0693 1,9516 97,58 6 0,0702 1,9772 98,86 Trung bình 98,15 RSD (%) 0,54
- 49 -
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp của dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
STT Độ hấp thụ (Abs) Nồng độ Ag của dung dịch thử (µg/ml) Hàm lượng bạc tìm được so với nhãn (%) 1 0,0719 2,0256 101,28 2 0,0714 2,0114 100,57 3 0,0717 2,0199 101,00 4 0,0718 2,0228 101,14 5 0,0716 2,0171 100,85 6 0,0715 2,0142 100,71 Trung bình 100,93 RSD (%) 0,26
Kết quả ở bảng 3.12 và 3.13 cho thấy quy trình đã xây dựng có độ lặp lại tốt, RSD = 0,54% (đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm) và RSD = 0,26% (đối với dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm).
Độ đúng
Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng cách khảo sát ở trên các mẫu tự tạo: tự tạo mẫu với các thành phần tá dƣợc nhƣ trong chế phẩm và hàm lƣợng bạc khoảng 80%, 100% và 120% so với hàm lƣợng nhãn. Tiến hành định lƣợng bạc với điều kiện hấp thụ nguyên tử nhƣ trên. Ở mỗi nồng độ tiến hành 03 lần thử nghiệm riêng biệt. Độ đúng đƣợc thể hiện qua tỷ lệ phần trăm gi a kết quả định lƣợng đƣợc so với lƣợng hoạt chất cho vào. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
- Chuẩn bị mẫu tự tạo 80% (Hỗn dịch nano bạc 800 ppm):
Pha dung dịch AgNO3: Lấy chính xác 100,0 ml nƣớc cất và 100,0 ml cồn 96º vào bình cầu đáy bằng 500 ml. Dùng đũa thủy tinh khuấy đồng nhất. Cân 1,5 gam PVP cho vào bình, khuấy cho tan hoàn toàn. Cân chính xác khoảng 0,3778 gam AgNO3 (Merck, hàm lƣợng: 100,0%) cho vào bình. Khuấy cho tan hoàn toàn. Cho
- 50 -
khuấy trên máy khuấy từ, cài tốc độ khuấy 500 vòng/phút.
Pha dung dịch NaBH4: Cân chính xác khoảng 0,0845 gam NaBH4, hòa tan trong 100 ml nƣớc cất.
Tạo hỗn dịch nano bạc 800 ppm: Lắp ống bơm. Một đầu cắm vào bình đựng NaBH4. Đầu còn lại có gắn đầu phun nhỏ để tạo tia và cắm vào bình cầu đáy bằng có chứa dung dịch AgNO3. Tốc độ bơm là 1,0 ml/phút. Chạy đến khi hết dung dịch NaBH4.
Tiến hành làm 03 lần.
- Chuẩn bị mẫu tự tạo 100% (Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm):
Tiến hành tƣơng tự mẫu tự tạo 80% nhƣng cân chính xác khoảng 0,4722 gam AgNO3 và 0,1056 gam NaBH4.
Tiến hành làm 03 lần.
- Chuẩn bị mẫu tự tạo 120% (Hỗn dịch nano bạc 1200 ppm):
Tiến hành tƣơng tự mẫu tự tạo 80% nhƣng cân chính xác khoảng 0,5667 gam AgNO3 và 0,1267 gam NaBH4.
Tiến hành làm 03 lần.
- Pha loãng đến nồng độ định lượng: Chuẩn bị 9 bình định mức 100,0 ml, hút chính xác 5,0 ml mỗi hỗn dịch nano bạc tự tạo ở trên vào từng bình, thêm 10 ml dung dịch acid nitric 10% lắc đều, đun cách thủy 10 phút, để nguội, thêm nƣớc trao đổi ion vừa đủ đến vạch thu đƣợc các dung dịch bạc 40 ppm (80%), 50 ppm (100%) và 60 ppm (120%). Pha loãng bằng dung dịch acid nitric 1% để đƣợc các dung dịch có nồng độ bạc khoảng 1,6 ppm (80%); 2,0 ppm (100%) và 2,4 ppm (120%).
- 51 -
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
Mức Lượng cân AgNO3 (g) Lượng Ag tương ứng (g) Lượng cân NaBH4 (g) Độ hấp thụ Lượng Ag tìm lại (g) Phần trăm thu hồi (%) 80% 0,3782 0,2403 0,0844 0,0560 0,2359 98,18 0,3777 0,2400 0,0841 0,0557 0,2346 97,78 0,3776 0,2399 0,0849 0,0556 0,2342 97,62 Trung bình 97,86% 100% 0,4717 0,2997 0,1053 0,0689 0,2910 97,12 0,4724 0,3001 0,1057 0,0693 0,2927 97,54 0,4728 0,3004 0,1054 0,0693 0,2927 97,46 Trung bình 97,37% 120% 0,5661 0,3596 0,1262 0,0831 0,3517 97,79 0,5664 0,3598 0,1264 0,0826 0,3496 97,15 0,5671 0,3603 0,1269 0,0831 0,3517 97,62 Trung bình 97,52%
Đối với dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Dung dịch mẫu nền đƣợc pha nhƣ sau:
- Sorbitol 10 gam - Isopropyl alcol 20 gam - Natri Saccharin 5 gam - Natri clorid 5 gam - Xylitol 1 gam - Thymol 1 gam - Màu Brilliant Blue FCF vừa đủ - Hƣơng liệu vừa đủ - Ethanol 90º 60 ml
- 52 -
Hút chính xác 200 µl, 250 µl, 300 µl dung dịch bạc chuẩn 1000 ppm vào các bình định mức 50,0 ml, thêm vừa đủ bằng dung dịch mẫu nền, lắc đều để đƣợc các dung dịch có chứa bạc 80%, 100% và 120% so với hàm lƣợng ghi trên nhãn. Hút chính xác 10,0 ml từ mỗi dung dịch tự tạo trên cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm dung dịch acid nitric 1% đến vừa đủ, lắc đều.
Ở mỗi mức nồng độ tiến hành làm 03 lần.
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng đối với nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Mức Nồng độ pha chế (ppm) Độ hấp thụ Nồng độ tìm lại (ppm) Phần trăm thu hồi (%) 80% 4,0000 0,0581 4,0812 102,03 4,0000 0,0592 4,1595 103,99 4,0000 0,0582 4,0883 102,21 Trung bình 102,74 100% 5,0000 0,0726 5,1140 102,28 5,0000 0,0719 5,0641 101,28 5,0000 0,0725 5,1068 102,14 Trung bình 101,90 120% 6,0000 0,0881 6,2179 103,63 6,0000 0,0881 6,2179 103,63 6,0000 0,0890 6,2821 104,70 Trung bình 103,99
Kết quả từ bảng 3.14 và bảng 3.15 cho thấy tỷ lệ thu hồi ở cả 3 mức nồng độ của mẫu tự tạo đều khá tốt từ 97,37% đến 97,86% (đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm) và từ 101,90% đến 103,99% (đối với nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm). Kết quả thu đƣợc chứng tỏ phƣơng pháp có độ đúng cao đảm bảo tốt cho các phép phân tích xác định hàm lƣợng bạc trong các chế phẩm hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm.
3.2.2.4. Định lượng bạc trong một số sản phẩm
Áp dụng phƣơng pháp phân tích xây dựng đƣợc để định lƣợng bạc trong các mẫu nghiên cứu: HD1, HD2, NSM1, NSM2. Mỗi mẫu làm 03 lần, kết quả thu đƣợc nhƣ ở Bảng 3.16.
- 53 -
Bảng 3.16. Hàm lượng bạc của các mẫu nghiên cứu
Mã mẫu Hàm lƣợng so với nhãn (%) RSD (%)
HD1 98,15 0,54
HD2 102,04 1,73 NSM1 100,93 0,26 NSM2 102,85 1,10
3.2.3. Đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc
3.2.3.1. Chuẩn bị môi trường và dung dịch pha loãng
Xem mục 2.2.4
3.2.3.2. Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn:
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
-Staphylococcus aureus ATCC 6538
-Streptococcus mutans ATCC 700610
-Streptococcus sanguinis ATCC 10556 Vi nấm:
-Candida albicans ATCC 10231
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật gốc:
Tăng sinh các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng thạch casein đậu tƣơng vô khuẩn, ủ ở 32 đến 35oC trong 24 h. Đối với vi nấm, tăng sinh trên môi trƣờng thạch Sabouraud, ủ ở 20 đến 25oC trong 48 h.
Sau thời gian ủ, cho vào mỗi ống môi trƣờng 5 ml nƣớc muối sinh lý vô khuẩn, rửa bề mặt thạch, tập trung dịch rửa vào một bình chứa vô khuẩn. Pha loãng dung dịch chủng thu đƣợc bằng nƣớc muối sinh lý và so sánh với độ đục chuẩn McFarland số 2 để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật gốc có nồng độ khoảng 6×108
CFU/ml. Hỗn dịch gốc này đƣợc bảo quản từ 2 – 8 ºC và sử dụng trong vòng 24 h sau khi gặt.
- 54 -
Đếm số lƣợng tế bào sống của mỗi hỗn dịch vi sinh vật gốc bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả trong chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV).
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật làm việc:
Dựa vào kết quả đếm số lƣợng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc, dùng dung dịch nƣớc muối sinh lý pha loãng hỗn dịch gốc để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật làm việc có nồng độ vi sinh vật từ 107 đến 108 CFU/ml.
3.2.3.3. Tiến hành
Hút 10 ml chế phẩm vào một ống nghiệm vô trùng. Cấy vào mỗi ống nghiệm hỗn dịch làm việc của một loại vi sinh vật thử nghiệm, trộn đều. Thể tích hỗn dịch chủng vi sinh vật làm việc chiếm 1,0 % thể tích mẫu.
Xác định số lƣợng vi sinh vật ở thời điểm 30 giây sau khi vi sinh vật tiếp xúc với mẫu bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả ở chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV).
Song song xác định lại số lƣợng vi sinh vật trong hỗn dịch vi sinh vật làm việc bằng phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ đối với mẫu thử.
- 55 -
3.2.3.4. Kết quả
Thử giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu:
Bảng 3.17. Giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu
Nước súc miệng nano bạc 5 ppm
Dung dịch AgNO3 trong nền nước súc miệng Vi khuẩn hiếu khí Vi nấm Vi khuẩn hiếu khí Vi nấm Đĩa 1 0 0 0 0 Đĩa 2 0 0 0 0
Kết quả < 1CFU/ml < 1 CFU/ml < 1 CFU/ml < 1CFU/ml
Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc:
Bảng 3.18. Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc
Chủng
Nồng độ pha loãng Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc (CFU/ml) 10-5 10-6 10-7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Nhiều Nhiều 268 271 × 107 Nhiều Nhiều 273 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Nhiều Nhiều 163 160 × 107 Nhiều Nhiều 157 Streptococcus mutans ATCC 700610 Nhiều Nhiều 35 39 × 107 Nhiều Nhiều 42 Streptococcus sanguinis ATCC 10556 Nhiều 105 9 102 × 106 Nhiều 98 9 Candida albicans ATCC 10231 Nhiều 32 3 31 × 106 Nhiều 29 4
- 56 -
Pha loãng hỗn dịch gốc bằng NaCl 0,9% để thu được hỗn dịch làm việc: Bảng 3.19. Pha chế hỗn dịch làm việc Chủng Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch gốc (CFU/ml) Thể tích hỗn dịch gốc Thể tích NaCl 0,9% Số lượng vi sinh vật trong hỗn dịch làm việc (CFU/ml) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 271 × 107