2.3.1.1. Kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc bằng SEM
- Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực hiện bằng ghi nhận và phân tích bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
- Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu đƣợc hình ảnh rõ nét của các tiểu phân bạc, để có thể xác định kích thƣớc của các tiểu phân nhỏ nhất, lớn nhất và tỷ lệ các tiểu phân hình cầu trên tổng số tiểu phân trên vi trƣờng.
2.3.1.2. Định tính, định lượng nano bạc bằng AAS
Khảo sát các điều kiện tối ưu cho định tính, định lượng nano bạc bằng AAS
Tiến hành khảo sát chọn điều kiện phân tích thích hợp nhằm định tính, định lƣợng đƣợc bạc trong các mẫu nghiên cứu trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử. Các điều kiện cần khảo sát bao gồm:
- Khảo sát lựa chọn nồng độ acid; - Khảo sát lựa chọn độ rộng khe; - Khảo sát lựa chọn tốc độ khí; - Khảo sát chiều cao đầu đốt.
Đánh giá phương pháp định tính, định lượng nano bạc bằng AAS [5] [19] [35]
- Tính thích hợp của hệ thống
Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách đo lặp lại nhiều lần dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại đáp ứng qua các lần đo.
Yêu cầu: chênh lệch đáp ứng gi a các lần đo của cùng một dung dịch (biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD) không lớn hơn 2%.
- Độ đặc hiệu của phương pháp
- 27 -
nhƣng không có hoạt chất. Tiến hành đo so sánh các mẫu: mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn.
Yêu cầu: Mẫu thử phải có vạch hấp thụ ở bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với vạch hấp thụ của bạc trong dung dịch bạc chuẩn. Đồng thời, mẫu placebo phải không có vạch hấp thụ ở bƣớc sóng 328,1 nm.
- Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy 5 – 7 dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric. Tiến hành đo độ hấp thụ theo các thông số đo đã khảo sát. Mối tƣơng quan gi a độ hấp thụ và nồng độ dung dịch chuẩn đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình và hệ số tƣơng quan hồi quy.
Yêu cầu: đƣờng hồi qui thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị hệ số tƣơng quan phải không nhỏ hơn 0,995.
- Độ lặp lại
Tiến hành phân tích ở mức nồng độ 100% với 6 mẫu thử độc lập của cùng một chế phẩm, tính toán hàm lƣợng Ag tìm lại đƣợc. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD (%);
Yêu cầu: RSD không lớn hơn 3%.
- Độ đúng
Xác định trên mẫu tự tạo. Khảo sát với 3 nồng độ của mẫu tự tạo: thêm chuẩn ở các mức 80%, 100% và 120% so với hàm lƣợng trên nhãn vào hỗn hợp tá dƣợc nhƣ trong công thức của thành phẩm. Ở mỗi mức nồng độ của mẫu tự tạo, tiến hành thực nghiệm 3 phép thử riêng biệt.
Yêu cầu: độ thu hồi (đƣợc phản ánh qua tỷ lệ phần trăm gi a kết quả định lƣợng so với hoạt chất cho vào) phải đạt từ 95% đến 105% (đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm) và từ 80% đến 110% (đối với dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm).
2.3.1.3. Đánh giá tác dụng diệt khuẩn
Phƣơng pháp tiếp xúc đƣợc sử dụng trong đánh giá tác dụng diệt khuẩn của các sản phẩm nano bạc
- 28 -
Nguyên tắc của phƣơng pháp là cấy một hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị thích hợp vào chế phẩm cần thử. Ủ chế phẩm đã cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp, sau đó lấy mẫu và đếm số lƣợng vi sinh vật sống còn lại trong sản phẩm sau khoảng thời gian ủ nhất định. [1] [6] [54]
Tiến hành đánh giá tác dụng diệt khuẩn của mẫu thử và so sánh với dung dịch AgNO3 5 ppm. Xác định số lƣợng vi sinh vật ở thời điểm bắt đầu thử nghiệm (R0) và thời điểm sau 30 giây tiếp xúc với chế phẩm (Rt). Tính lƣợng giảm đi của vi sinh vật chỉ thị tại thời điểm Rt:
R (CFU/ml) = Ro - Rt
Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc bằng: R × 100/ R0.
2.3.1.4. Xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cho các sản phẩm nghiên cứu
Trên cơ sở kết quả xây dựng và thẩm định các phƣơng pháp kiểm nghiệm đã đƣa ra ở trên, tiến hành xây dựng dự thảo một số chỉ tiêu kiểm nghiệm đối với các sản phẩm nano bạc nghiên cứu.
2.3.2. Khảo sát một số ảnh hƣởng tới hình dạng, kích thƣớc hạt nano bạc
2.3.2.1. Tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30
Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30 tới hình dạng, kích thƣớc hạt nano bạc tạo thành.
2.3.2.2. Tốc độ khuấy dung dịch AgNO3
Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ khuấy AgNO3 tới kích thƣớc hạt nano bạc tạo thành.
2.3.2.3. Tốc độ bơm NaBH4
Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ bơm NaBH4 tới hình dạng và kích thƣớc hạt nano bạc tạo thành.
2.3.3. Áp dụng để kiểm nghiệm một số sản phẩm
Áp dụng các chỉ tiêu xây dựng đƣợc để kiểm nghiệm các mẫu nghiên cứu: HD1, HD2, NSM1, NSM2.
- 29 -
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tính toán và xác định các đại lƣợng đặc trƣng của các mẫu thống kê bằng Microsoft Excel.
- 30 -
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH BÀO CHẾ TỚI HÌNH DẠNG, KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN BẠC BÀO CHẾ TỚI HÌNH DẠNG, KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN BẠC
Kiểm tra hình dạng và kích thƣớc các tiểu phân bạc của các chế phẩm bào chế đƣợc bằng kính hiển vi điện tử quét (đƣợc tiến hành nhƣ mô tả ở mục 3.2.1 dƣới đây). Kết quả giúp chọn đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình bào chế đạt đƣợc các yêu cầu cần thiết về hình dạng và kích thƣớc của các tiểu phân bạc.
Dƣới đây là sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm.
bơm 1-1,5 vòng/ phút
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
1 lít nƣớc cất 15 gam PVP Dung dịch PVP Hệ AgNO3; PVP; ethanol đồng nhất 1 lít Ethanol 96º 4,72 gam AgNO3 1,06 gam NaBH4 1 lít nƣớc cất 3 lít hỗn dịch nano bạc 1000 ppm Khuấy liên tục 500 vòng/phút
- 31 -
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình bào chế dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm
3.1.1. Tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30
Tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP-K30 ảnh hƣởng trực tiếp tới hình dạng, kích thƣớc của hạt bạc tạo ra. Khi nồng độ PVP-K30 quá thấp sẽ không đủ khả năng bao các hạt Ag mới tạo ra từ phản ứng, gây hiện tƣợng kết hợp tạo ra hạt Ag kích thƣớc lớn. Nhƣng khi nồng độ PVP-K30 quá cao sẽ khiến dung dịch AgNO3 có độ nhớt cao, phản ứng xảy ra chậm, tốn thời gian, tốn kém và khó điều chỉnh tốc độ phản ứng, các hạt nano bạc tạo ra phân tán không đều.
Nhóm nghiên cứu đã khảo sát tại các tỷ lệ nồng độ AgNO3: PVP-K30 là 1:1; 1:1,5; 1:2, 1:2,5; 1:3; 1:3,5; 1:4. Sau khi tiến hành pha chế tại các tỷ lệ nồng độ
Isopropyl alcol, Sorbitol Ethanol 90º NaCl, Thymol, Natrisaccharin, xylitol, Nƣớc RO Khuấy 10 phút Khuấy 20 phút Khuấy 10 phút Khuấy 1 giờ Màu Brilliant Blue FCF, hƣơng liệu, hỗn dịch nano bạc 1000 ppm Dung dịch súc miệng nano bạc 5 ppm
- 32 -
AgNO3: PVP-K30 là 1:1; 1:1,5; 1:2, 1:2,5 các hạt Ag tạo ra có kích thƣớc lớn, dung dịch vẫn đục. Tại tỷ lệ 1:3; 1:3,5; 1:4 các hạt Ag tạo ra có hình dáng tròn, kích thƣớc nhỏ, đều (< 100 nm).
Dựa trên kết quả khảo sát, nhóm nghiên cứu quyết định sử dụng tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30 là 1:3.
3.1.2. Tốc độ khuấy dung dịch AgNO3
Khi bơm NaBH4 vào dung dịch AgNO3 cần sử dụng khuấy từ để phân tán đều NaBH4 cũng nhƣ hạt Ag đƣợc tạo ra sau phản ứng. Do đó nếu tốc độ khuấy quá chậm sẽ không đủ phân tán Ag tạo ra sau phản ứng, gây hiện tƣợng kết hợp tạo hạt Ag có kích thƣớc lớn. Nhƣng nếu để tốc độ khuấy quá cao. Sẽ tạo luồng xoáy mạnh và bọt khí trong dung dịch AgNO3 khiến phản ứng xảy ra không đều, dễ gây tủa. Qua khảo sát, tốc độ khuấy tại 500 vòng/phút là phù hợp.
3.1.3. Tốc độ bơm NaBH4
Theo cơ chế của phƣơng pháp thì tốc độ bơm NaBH4 càng nhỏ càng chậm càng tốt. Tuy nhiên dung dịch NaBH4 dễ bị phân hủy theo phản ứng:
NaBH4 + 2H2O → NaBO2 + 4H2↑
Do đó cần lựa chọn tốc độ bơm thích hợp. Qua khảo sát tốc độ bơm NaBH4 ở mức 1 – 1,5 ml/phút cho kết quả hạt Ag có hình dạng đều và kích thƣớc nhỏ phù hợp (< 100 nm).
Qua khảo sát đã xác định đƣợc một số điều kiện thích hợp để bào chế các chế phẩm nano bạc có hình dạng tiểu phân đồng đều và kích thƣớc dƣới 100nm nhƣ sau:
- Tỷ lệ nồng độ AgNO3 và PVP - K30 là 1:3. - Tốc độ khuấy dung dịch AgNO3: 500 vòng/phút. - Tốc độ bơm NaBH4: 1,0 – 1,5 ml/phút.
3.2. XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM
3.2.1. Kiểm nghiệm hình dạng và kích thƣớc nano bạc bằng SEM
Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử
- 33 -
hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực hiện bằng ghi nhận và phân tích bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu đƣợc hình ảnh rõ nét của các tiểu phân bạc, để có thể xác định kích thƣớc của các tiểu phân nhỏ nhất, lớn nhất và tỷ lệ các tiểu phân hình cầu trên tổng số tiểu phân trên vi trƣờng.
Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800 với các thông số nhƣ sau:
-Súng điện tử: Nguồn điện tử phát xạ trƣờng lạnh.
- Thế gia tốc: 0,5 kV đến 30 kV
- Đầu dò: Điện tử thứ cấp.
- Độ phóng đại: 20 lần đến 800000 lần
- Độ phân giải: 1 nm đến 5 nm.
- Giá đỡ mẫu: Hình trụ bằng nhôm
- Băng carbon có diện tích khoảng 10 mm2
- Máy sấy.
3.2.1.1. Chuẩn bị mẫu
Đặt mẫu:
Lấy khoảng 20 µl chế phẩm, nhỏ lên băng carbon đã đƣợc làm sạch bằng ethanol tuyệt đối, vừa nhỏ vừa sấy sao cho chế phẩm đƣợc dàn đều và khô đều.
Tạo màng dẫn điện:
Phủ màng kim loại lên mẫu bằng phƣơng pháp tạo màng phún xạ (sputtering). Sau khi đặt giá đỡ đã gắn mẫu vào buồng mẫu, dùng bơm hút chân không tới áp suất 0,1 Pa để loại bỏ nƣớc và oxy. Tiến hành quá trình phủ màng kim loại lên mặt mẫu, rồi đƣa vào đo ngay.
3.2.1.2. Tiến hành đo
Gắn mẫu vào giá, lấy tiêu cự và đo ở thế gia tốc 4 kV đến 5 kV với cƣờng độ dòng điện 10 µA.
Điều chỉnh độ phóng đại thích hợp để chụp ảnh các tiểu phân nano bạc, chỉnh sao cho ảnh rõ nét nhất, tiến hành chụp và ghi lại ảnh.
- 34 -
3.2.1.3. Đánh giá
Chọn 6 vị trí, mỗi vị trí khoảng 1 μm2, tại các điểm bất kỳ của ảnh trên màn hình. Xử lý để thu các kết quả sau:
- Tỷ lệ tiểu phân hình cầu: Đếm tổng số tiểu phân và số lƣợng tiểu phân hình cầu tại các vị trí quan sát. Tính tỷ lệ trung bình của tiểu phân hình cầu so với tổng số tiểu phân tại các vị trí.
- Kích thƣớc của tiểu phân bạc: Đo kích thƣớc của tiểu phân lớn nhất, tiểu phân nhỏ nhất và kích thƣớc (một cách tƣơng đối) của đa số tiểu phân trong vi trƣờng theo thƣớc đo trên ảnh.
3.2.1.4. Kết quả đo
Tiến hành kiểm nghiệm hình dạng và kích thƣớc các tiểu phân bạc của 02 mẫu hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và 02 mẫu dung dịch nƣớc súc miệng 5 ppm. Dƣới đây là ảnh đại diện về hình dạng, kích thƣớc của các tiểu phân bạc.
- 35 -
Hình 3.9. Ảnh SEM của hỗn dịch nano bạc 1000 ppm, (mẫu HD2)
- 36 -
Hình 3.11. Ảnh SEM của dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm, (mẫu NSM2) Bảng 3.5. Kết quả kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc
của 04 mẫu thử bằng SEM
Chỉ tiêu HD1 HD2 NSM1 NSM2
Tỷ lệ tiểu phân bạc hình cầu
(%) 94,5 96,6 95,1 94,8 Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn nhất (nm) 58 55 58 55 Kích thƣớc tiểu phân bạc bé nhất (nm) 25 25 25 25 Tỷ lệ tiểu phân bạc có kích thƣớc 30 nm đến 40 nm (%) 92,9 93,6 91,4 90,8 Kết quả thu đƣợc ghi trong Bảng 3.5 cho thấy cả 4 mẫu nano bạc thử nghiệm đều có kích thƣớc tiểu phân bạc ở mức nano (25 nm đến 58 nm) với đa số trong khoảng 30 nm đến 40 nm (90,8% đến 93,6%) và tỷ lệ tiểu phân bạc hình cầu khá cao (94,5% đến 96,6%).
- 37 -
3.2.1.5. Dự kiến chỉ tiêu về hình dạng và kích thước các tiểu phân bạc
Từ các kết quả trên có thể đƣa ra dự kiến chỉ tiêu về hình dạng và kích thƣớc các tiểu phân bạc trong chế phẩm nghiên cứu nhƣ sau:
- Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để quan sát hình dạng và ƣớc lƣợng kích thƣớc các tiểu phân bạc.
- Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn nhất phải dƣới 100 nm.
- Tỷ lệ các tiểu phân bạc có kích thƣớc 30 - 40nm phải không dƣới 90%. - Tỷ lệ các tiểu phân bạc có hình cầu phải đạt trên 90%.
3.2.2. Định tính, định lƣợng nano bạc bằng AAS
3.2.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phân tích bạc bằng AAS
Khảo sát lựa chọn nồng độ acid
Nồng độ axit trong dung dịch mẫu luôn luôn có ảnh hƣởng đến cƣờng độ của vạch phổ của nguyên tố phân tích thông qua tốc độ dẫn mẫu, khả năng hóa hơi và nguyên tử hóa của mẫu. Ảnh hƣởng này thƣờng gắn liền với loại Anion của axit. Nói chung, các axit càng khó bay hơi và bền nhiệt, càng làm giảm nhiều cƣờng độ vạch phổ hấp thụ của nguyên tố phân tích. Các axit dễ bay hơi gây ảnh hƣởng nhỏ. Các axit làm giảm cƣờng độ vạch phổ theo thứ tự: HClO4 < HCl < HNO3 < H2SO4 < H3PO4 < HF, nghĩa là axit HClO4,HCl và HNO3 gây ảnh hƣởngnhỏ nhất trong vùng nồng độ nhỏ. Chính vì thế trong thực tế phân tích của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ngƣời ta thƣờng dùng môi trƣờng là axit HCl hay HNO3 1 hay 2%. Vì ở nồng độ nhƣ thế ảnh hƣởng của hai axit này là không đáng kể (nhỏ hơn 5%).
Bạc là nguyên tố dễ hòa tan trong dung dịch acid nitric để tạo thành muối bạc nitrat. Để khảo sát nồng độ dung dịch acid nitric, tiến hành pha dung dịch bạc chuẩn 2 ppm trong dung dịch acid nitric có nồng độ khác nhau, đo độ hấp thụ AAS. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.6
- 38 -
Bảng 3.6. Độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm, pha trong dung dịch acid nitric có nồng độ khác nhau.
Nồng độ acid nitric (%)
Độ hấp thụ (Abs)
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
0,2 0,0503 0,0510 0,0506 0,0506 1,0 0,0641 0,0639 0,0638 0,0639 1,5 0,0636 0,0628 0,0631 0,0632 2,0 0,0629 0,0634 0,0633 0,0632 0.045 0.05 0.055 0.06 0.065 0.07 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Đ ộ h ấp t h ụ ( A b s) Nồng độ acid (%)
Hình 3.12. Biến thiên độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm pha trong các