Cấu tạo của một máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) gồm các bộ phận chính sau: Nguồn bức xạ, bộ phận hóa hơi hay nguyên tử hóa mẫu, bộ phận đơn sắc hóa, bộ phận phát hiện và khuếch đại tín hiệu.
- Nguồn phát tia bức xạ cộng hƣởng của nguyên tố cần phân tích: thƣờng là đèn cathod rỗng HCL (Hollow Cathode Lamp) hoặc đèn phóng điện không cực EDL (Electronic Discharge Lamp) hoặc đèn phổ liên tục có biến điệu.
- Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích, có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu:
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa F-AAS (Flame AAS), sử dụng khí C2H2 và không khí nén hoặc dinitơ oxid (N2O).
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa ETA-AAS (Electro -Thermal- Atomization AAS): kỹ thuật này thực hiện quá trình nguyên tử hóa mẫu trong thời gian rất ngắn nhờ vào năng lƣợng của dòng điện có công suất lớn và trong môi trƣờng khí trơ.
- Bộ đơn sắc hóa thƣờng đặt sau bộ phận nguyên tử hóa mẫu với mục đích chọn vạch cộng hƣởng từ nguồn bức xạ nhiều vạch và loại bỏ nh ng vạch nhiễu do chính ngọn lửa phát ra.
- 18 -
1.2.5.3. Phương pháp AAS với kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa
Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa là dùng năng lƣợng của ngọn lửa đèn khí để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích.
Để tạo ra ngọn lửa, có thể đốt cháy nhiều hỗn hợp khí khác nhau trong các đèn khí thích hợp bao gồm một khí oxy hóa và một khí cháy. Các hỗn hợp khí đƣợc dùng phải đảm bảo các yêu cầu nhất định để dùng vào mục đích hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích. Các hỗn hợp khí đƣợc dùng nhiều nhất trong phép đo F-AAS là: acetylen và không khí nén, N2O và acetylen hay hydro và acetylen [15]
Các quá trình xảy ra trong ngọn lửa:
Trong ngọn lửa có nhiều quá trình đồng thời xảy ra, có quá trình chính và cũng có quá trình phụ. Trong đó, nhiệt độ của ngọn lửa là yếu tố quyết định mọi diễn biến của các quá trình đó.
Trƣớc hết, khi mẫu ở thể sol khí đƣợc dẫn lên đèn nguyên tử hóa, dƣới tác dụng nhiệt của ngọn lửa, ở miệng đèn, là sự bay hơi của dung môi hòa tan và các chất h u cơ trong thể sol khí. Mẫu còn lại là các hạt rắn rất nhỏ mịn (các muối của các chất) trong ngọn lửa và nó đƣợc dẫn tiếp vào vùng trung tâm ngọn lửa. Tiếp đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa của các hạt mẫu khô. Các quá trình này xảy ra thƣờng theo hai cơ chế chính:
- Nếu Eh < En tức năng lƣợng hóa hơi Eh của các hợp phần có trong mẫu nhỏ hơn năng lƣợng nguyên tử hóa En của nó thì trƣớc hết các hợp phần này sẽ hóa hơi ở dạng phân tử. Sau đó các phân tử này mới bị phân ly thành các nguyên tử tự do:
MnAm (L) → MnAm (K) → nM0(K) + mA(K). M0(K) + n(hv) → phổ AAS.
- Nếu Eh > En tức năng lƣợng phân ly Eh của các hợp phần của mẫu nhỏ hơn năng lƣợng hóa hơi Eh thì trƣớc hết các hợp phần đó sẽ bị phân ly thành các nguyên tử tự do rồi sau đó mới hóa hơi:
nMnAm(L) → nM(R,L) + mA(L,R) → nM0
(K). M0(K) + n(hv) → phổ AAS
- 19 -
Bên cạnh các quá trình chính, trong ngọn lửa đèn khí còn một số quá trình phụ (sự ion hóa của nguyên tố phân tích, sự phát xạ, sự hấp thụ của phân tử, sự tạo thành hợp chất bền nhiệt).
1.2.6. Các phƣơng pháp định lƣợng bạc
- Dùng phương pháp chuẩn độ: [2]
Phƣơng pháp này chỉ áp dụng cho các trƣờng hợp lƣợng bạc đủ lớn để có thể phát hiện sự thay đổi về màu sắc hay điện thế.
+ Phƣơng pháp Mohr: Cho muối bạc nitrat phản ứng với natri clorid, chỉ thị là Kali cromat, khi tới gần điểm tƣơng đƣơng một lƣợng dƣ Ag+
phản ứng với CrO42- tạo ra kết tủa đỏ gạch Ag2CrO4.
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ (trắng). 2Ag+ + CrO42- → Ag2CrO4 (đỏ gạch)
+ Cho muối bạc phản ứng với natri clorid trong môi trƣờng acid, điểm tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp đo thế.
+ Phƣơng pháp Volhard: Cho muối bạc nitrat dƣ phản ứng với natri clorid trong môi trƣờng acid, định lƣợng muối bạc dƣ bằng dung dịch KSCN với chỉ thị phèn sắt amon và thêm một lƣợng nhỏ nitrobenzen:
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ Ag+ + SCN- → AgSCN ↓ Fe3+ + SCN- → Fe(SCN)2+ (màu đỏ)
+ Phƣơng pháp Fajans: Cho muối bạc nitrat phản ứng với natri clorid, chỉ thị fluorescein, gần điểm tƣơng đƣơng dung dịch từ màu vàng chuyển sang màu hồng:
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ HFlu ↔ H+ + Flu- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trƣớc điểm tƣơng đƣơng, lƣợng AgNO3 cho vào còn thiếu nên tủa tạo thành hấp phụ Cl-
dƣ trong dung dịch, vì vậy các hạt kết tủa mang điện tích âm. Sau điểm tƣơng đƣơng, Ag+
- 20 -
dƣơng sẽ hấp phụ anion Flu- của chỉ thị, làm nó chuyển từ màu vàng sang màu hồng. Sự chuyển màu này giúp ta phát hiện điểm kết thúc của chuẩn độ.
+ Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp hóa học định tính, định lƣợng bạc: - Các phép định tính chỉ phát hiện đƣợc bạc ở dạng ion.
- Yêu cầu một lƣợng mẫu lớn.
- Độ chính xác và độ nhạy không cao khi phân tích mẫu chỉ chứa bạc ở dạng vi lƣợng.
1.3. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA NANO BẠC BẠC
Phƣơng pháp tiếp xúc đƣợc sử dụng trong đánh giá tác dụng diệt khuẩn nano bạc
1.3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc của phƣơng pháp là cấy một hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị thích hợp vào chế phẩm cần thử, tốt nhất là cấy trực tiếp vào bao bì đóng gói cuối cùng của sản phẩm, nếu có thể. Ủ chế phẩm đã cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp, sau đó lấy mẫu và đếm số lƣợng vi sinh vật sống còn lại trong sản phẩm sau khoảng thời gian ủ nhất định. [6]
1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý và khả năng gây bệnh của một số loài VSV dùng trong nghiên cứu [4] [8] dùng trong nghiên cứu [4] [8]
Phƣơng pháp tiếp xúc sử dụng 5 loài VSV chỉ thị bao gồm:
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Streptococcus mutans ATCC 700610
- Streptococcus sanguinis ATCC 10556 - Candida albicans ATCC 10231
- 21 -
- Đặc điểm hình thái: là VSV Eucaryote, cơ thể là nh ng tế bào nhỏ hình trứng, có khi có chồi nhỏ.
- Sinh sản: vô tính bằng cách nảy chồi, h u tính bằng cách hình thành túi bào tử.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Môi trƣờng Sabouraud là môi trƣờng nuôi cấy cơ bản. Điều kiện thích hợp là: pH = 5,8-6,2; nhiệt độ = 25-28°C.
+ Môi trƣờng Sabouraud lỏng: tạo váng trên bề mặt;
+ Môi trƣờng Sabouraud đặc: khuẩn lạc to, nhẵn, màu trắng đục.
- Khả năng gây bệnh: là nấm men ký sinh trong ống tiêu hóa, gặp điều kiện thuận lợi có thể gây bệnh nhƣ: tƣa lƣỡi ở trẻ em, viêm thực quản, viêm da, viêm âm đạo,…
1.3.2.2. Streptococcus mutans
Cho đến nay Streptococcus mutans đƣợc xem là tác nhân chính gây ra sâu răng. Vi khuẩn này lên men carbohydrate tạo ra acid, làm pH giảm xuống < 5, sự giảm pH liên tục có thể đƣa đến sự khử khoáng trên bề mặt răng, làm mất vôi ở các mô cứng của răng, khởi phát quá trình sâu răng.
Cơ chế chính xác để S.mutans bám dính và tích tụ trên bề mặt thì chƣa rõ nhƣng S.mutans đƣợc nghĩ là yếu tố gây bệnh vì chúng có khả năng tạo glucans ngoại bào từ sucrose. Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có thể tổng hợp polysaccharide nhƣ glucans hoặc destrans lại không thể gây sang thƣơng sâu răng. Có lẽ có nh ng yếu tố khác ảnh hƣởng đến độc lực của S.mutans. Ngƣời ta nhận thấy, S.mutans
chứa nh ng phân tử polypeptide có thể tạo liên kết đồng hóa trị, đó có thể là phƣơng tiện để vi khuẩn bám dính vào bề mặt răng.
1.3.2.3. Streptococcus sanguinis
Streptococcus sanguinis là một chủng vi khuẩn Gram (+). Chủng vi khuẩn này có khả năng hô hấp, sản xuất và chống chịu với H2O2. Chủng vi khuẩn này cũng có hoạt tính các enzyme NADH oxidase và superoxide dismutase cao, gợi ý (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- 22 -
rằng chính các enzyme này ñã tham gia vào quá trình bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi tổn thƣơng do axit và H2O2.
1.3.2.4. Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-),có một lông ở một đầu, không sinh nha bào.
- Hô hấp: hiếu khí tuyệt đối;
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, thích hợp nhất ở pH = 7,2-7,5; nhiệt độ = 37°C.
+ Môi trƣờng canh thang: tạo váng trên bề mặt;
+ Môi trƣờng thạch thƣờng: khuẩn lạc nhỏ, màu xanh, bề mặt nhẵn hoặc xù xì.
- Tính chất đặc trƣng: có khả năng sinh 2 loại sắc tố là fluorescin (có màu xanh vàng) và pyocyanin (có màu xanh lục nhạt).
- Khả năng gây bệnh: là nguyên nhân của nh ng bệnh nhiễm trùng cơ hội. Tại nơi nhiễm trùng chúng gây ra tổn thƣơng có mủ màu xanh. Gặp điều kiện thuận lợi, có thể gây nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, viêm màng não…
1.3.2.5. Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng)
- Đặc điểm hình thái : cầu khuẩn Gram (+) mọc thành từng đám, không hình thành nha bào, không di động.
- Hô hấp : hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện.
- Đặc điểm nuôi cấy : dễ phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng.
+ Môi trƣờng canh thang : sau 5-6 giờ làm đục môi trƣờng, sau 24 giờ có hiện tƣợng lắng cặn ;
+ Môi trƣờng thạch thƣờng: khuẩn lạc tƣơng đối tròn, mép đều đặn, màu vàng sẫm. - Khả năng gây bệnh: có thể gây nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm trùng huyết, nhiễm độc thức ăn, viêm ruột cấp…
- 23 -
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Một số chế phẩm có chứa nano bạc dùng trong y tế đƣợc bào chế tại Khoa Nghiên cứu & phát triển – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng, bao gồm:
Bảng 2.2. Các mẫu nghiên cứu
TT Ký hiệu Tên mẫu Thời gian
pha chế
Thể tích
Mẫu 1 HD1 Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 10/2016 3 lít Mẫu 2 HD2 Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 12/2016 3 lít Mẫu 3 NSM1 Nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm 10/2016 2 lít Mẫu 4 NSM2 Nƣớc súc miệng nano bạc 5 ppm 12/2016 2 lít
Bảng 2.3. Công thức cho 3 lít hỗn dịch nano bạc 1000 ppm
STT Tên nguyên liệu Số lƣợng
1 Bạc nitrat (AgNO3) 4,72 gam 2 Natri tetrahydroborat (NaBH4) 1,06 gam 3 Polyvinylpyrrolidon (PVP-K30) 15 gam 4 Ethanol 96º 1 lít 5 Nƣớc cất 2 lít
Bảng 2.4. Công thức cho 1 lít dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Tên nguyên liệu Số lƣợng
1 Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 5 ml 2 Sorbitol 10 g 3 Isopropyl alcol 20 g 4 Natri Saccharin 5 g 5 Natri clorid 5 g 6 Xylitol 1 g
- 24 -
STT Tên nguyên liệu Số lƣợng
7 Thymol 1 g
8 Màu Brilliant Blue FCF Vừa đủ 9 Hƣơng liệu Vừa đủ 10 Ethanol 90º 60 ml 11 Nƣớc RO Vừa đủ 1 lít 2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Chất chuẩn
- Dung dịch bạc chuẩn 1000 ppm (Merck, Đức).
2.2.2. Chủng chuẩn
Vi khuẩn:
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Streptococcus mutans ATCC 700610
- Streptococcus sanguinis ATCC 10556
Vi nấm:
- Candida albicans ATCC 10231
2.2.3. Hóa chất, dung môi
- Bạc nitrat (Merck, Đức)
- Acid nitric tinh khiết AAS (Merck, Đức);
- Nƣớc cất, nƣớc trao đổi ionđạt tiêu chuẩn DĐVN IV;
2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy VSV
Môi trường thạch Casein đậu tương (Soyabean Casein Digest Agar)
Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g Đậu tƣơng thủy phân 5,0 g NaCl 5,0 g
Nƣớc 1000 ml
- 25 -
Môi trường thạch Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar)
Dextrose 40,0 g Hỗn hợp của Pepton và đậu tƣơng
thủy phân bởi pancreatin (1:1) 5,0 g Thạch 15,0 g Nƣớc 1000 ml pH 5,6 ± 0,2
Độ đục chuẩn McFarland số 2
Hút chính xác 2,0 ml dung dịch bari clorid 0,048 M vào bình định mức dung tích 100 ml. Pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 0,18 M vừa đủ đến vạch, trộn đều. Độ hấp phụ của độ đục chuẩn số 2 khi đo ở bƣớc sóng 625 nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18 M làm mẫu trắng, phải nằm trong khoảng 0,32 - 0,40. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.5. Thiết bị, dụng cụ
2.2.5.1. Thiết bị:
Các thiết bị định kỳ đƣợc hiệu chuẩn đạt tiêu chuẩn GLP và ISO 17025
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS HITACHI Z-5000 có trang bị đèn catod rỗng, đầu đốt sử dụng ngọn lửa acetylen – không khí nén.
- Kính hiển vi điện tử quét FE-SEM Hitachi S-4800.
- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S có độ chính xác 0,1mg. - Máy đo pH.
- Nồi hấp Hyrayana, nồi hấp Tomy. - Tủ ấm Memmert BP 600.
- Máy lắc Vortex Genie2.
- Tủ an toàn sinh học (Biosafety cabinet). - Tủ sấy Memmert ULE 600.
2.2.5.2. Dụng cụ
Bình định mức, pipet chính xác, bình nón, cốc và các dụng cụ thủy tinh khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích.
- 26 -
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm
2.3.1.1. Kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc bằng SEM
- Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực hiện bằng ghi nhận và phân tích bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
- Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu đƣợc hình ảnh rõ nét của các tiểu phân bạc, để có thể xác định kích thƣớc của các tiểu phân nhỏ nhất, lớn nhất và tỷ lệ các tiểu phân hình cầu trên tổng số tiểu phân trên vi trƣờng.
2.3.1.2. Định tính, định lượng nano bạc bằng AAS
Khảo sát các điều kiện tối ưu cho định tính, định lượng nano bạc bằng AAS
Tiến hành khảo sát chọn điều kiện phân tích thích hợp nhằm định tính, định lƣợng đƣợc bạc trong các mẫu nghiên cứu trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử. Các điều kiện cần khảo sát bao gồm:
- Khảo sát lựa chọn nồng độ acid; - Khảo sát lựa chọn độ rộng khe; - Khảo sát lựa chọn tốc độ khí; - Khảo sát chiều cao đầu đốt.
Đánh giá phương pháp định tính, định lượng nano bạc bằng AAS [5] [19] [35]
- Tính thích hợp của hệ thống
Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách đo lặp lại nhiều lần dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại đáp ứng qua các lần đo.
Yêu cầu: chênh lệch đáp ứng gi a các lần đo của cùng một dung dịch (biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD) không lớn hơn 2%.
- Độ đặc hiệu của phương pháp
- 27 -
nhƣng không có hoạt chất. Tiến hành đo so sánh các mẫu: mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn.
Yêu cầu: Mẫu thử phải có vạch hấp thụ ở bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với vạch hấp thụ của bạc trong dung dịch bạc chuẩn. Đồng thời, mẫu placebo phải không có vạch hấp thụ ở bƣớc sóng 328,1 nm.
- Khoảng tuyến tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị dãy 5 – 7 dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric. Tiến hành đo độ hấp thụ theo các thông số đo đã khảo sát. Mối tƣơng quan gi a độ hấp thụ và nồng độ dung dịch chuẩn đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình và hệ số tƣơng quan hồi quy.
Yêu cầu: đƣờng hồi qui thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị hệ số