Trong TEM, chùm điện tử đƣợc sử dụng thay cho ánh sáng trong kính hiển vi quang học. Điện tử đƣợc phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm điện tử: sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử và sử dụng súng phát xạ trƣờng. [11]
Phƣơng pháp TEM cho bức ảnh chân thực về kích thƣớc hạt của vật liệu. Nhờ cách tạo ảnh nhiễu xạ, vi nhiễu xạ và nano nhiễu xạ, kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua còn cho biết nhiều thông tin chính xác về cách sắp xếp các nguyên tử trong mẫu, theo dõi đƣợc cách sắp xếp đó trong chi tiết từng hạt, từng diện tích cỡ micromet vuông và nhỏ hơn. Ảnh của hiển vi điện tử truyền qua cho phép ngƣời ta quan sát đƣợc hình dạng và xác định đƣợc kích thƣớc của các hạt nano.
Hình 1.5. Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 20 nm
1.2.2.3. Ưu điểm và hạn chế của TEM
Dù đƣợc phát triển từ rất lâu, nhƣng đến thời điểm hiện tại, TEM vẫn là một công cụ nghiên cứu mạnh và hiện đại trong nghiên cứu về cấu trúc vật rắn, đƣợc sử dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, khoa học vật liệu, công nghệ nano, hóa học, sinh học, y học... và vẫn đang trong quá trình phát triển với nhiều tính năng mạnh mới.
Điểm mạnh của TEM
- Có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tƣơng phản, độ phân giải (kể cả không gian và thời gian) rất cao đồng thời dễ dàng cung cấp các thông tin về cấu
- 15 -
trúc. Khác với dòng kính hiển vi quét đầu dò, TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử.
- Đi kèm với các hình ảnh chất lƣợng cao là nhiều phép phân tích rất h u ích đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu.
Điểm yếu của TEM
- Đắt tiền: TEM có nhiều tính năng mạnh và là thiết bị rất hiện đại do đó giá thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao ví dụ chân không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm.
- Đòi hỏi nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá hủy mẫu (điều này không thích hợp với nhiều tiêu bản sinh học).
- Việc điều khiển TEM rất phức tạp và đòi hỏi nhiều bƣớc thực hiện chính xác cao.
1.2.3. Kính hiển vi điện tử quét
1.2.3.1. Giới thiệu
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật đƣợc thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
1.2.3.2. Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong SEM
Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống nhƣ việc tạo ra chùm điện tử trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử đƣợc phát ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt hay phát xạ trƣờng...), sau đó đƣợc tăng tốc. Tuy nhiên, thế tăng tốc của SEM thƣờng chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bƣớc sóng quá nhỏ vào một điểm kích thƣớc nhỏ sẽ rất khó khăn. Điện tử đƣợc phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện. Độ phân giải của SEM đƣợc
- 16 -
xác định từ kích thƣớc chùm điện tử hội tụ, mà kích thƣớc của chùm điện tử này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt đƣợc độ phân giải tốt nhƣ TEM. Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn phụ thuộc vào tƣơng tác gi a vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử. Khi điện tử tƣơng tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích đƣợc thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này. Các bức xạ chủ yếu gồm: Điện tử thứ cấp (Secondary electrons) và điện tử tán xạ ngƣợc (Backscattered electrons). [10] [54] [55]
1.2.3.3. Ưu điểm của kính hiển vi điện tử quét
Mặc dù không thể có độ phân giải tốt nhƣ kính hiển vi điện tử truyền qua nhƣng kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp. Một điểm mạnh khác của SEM là các thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng. Một điều khác là giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM phổ biến hơn rất nhiều so với TEM.
1.2.4. Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động
Tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering, DLS) là một kỹ thuật trong vật lý, dựa vào sự tƣơng tác của ánh sáng laser với các hạt và phân tích các biến động cƣờng độ ánh sáng để đo chuyển động Brown. Phƣơng pháp này có thể đƣợc sử dụng để đo kích thƣớc hạt đặc biệt là trong khoảng 2-500 nm. [30] [52] [53]
Ƣu điểm của DLS là: đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, rút ngắn thời gian đo lƣờng. Do đó, các kỹ thuật đang ngày càng đƣợc sử dụng để mô tả các đặc điểm của hạt nano (tính toán kích thƣớc hạt, đƣa ra phân bố kích thƣớc hạt và chỉ số đa tán sắc) trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghiệp. [25] [47] [52]
Mặc dù kỹ thuật DLS đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ vậy, nhƣng DLS cũng gặp một số vấn đề trong trƣờng hợp đo mẫu có kích thƣớc lớn. Có nhiều công trình về việc sử dụng DLS để đo lƣờng các hạt nano kim loại có kích thƣớc khác nhau [24]
- 17 -
[33] [57] nhƣng nhìn chung các nhà nghiên cứu không áp dụng cho hạt nano kim loại với kích thƣớc trên 100 nm. [36] [50] [56]
1.2.5. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
1.2.5.1. Nguyên tắc
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phƣơng pháp xác định nồng độ của nguyên tố trong một chất bằng cách đo độ hấp thụ bức xạ bởi hơi nguyên tử tự do của nguyên tố đó đƣợc hoá hơi từ chất thử. Việc định lƣợng đƣợc tiến hành ở bƣớc sóng của một trong nh ng vạch hấp thụ của nguyên tố cần xác định [3] [6] [15] [31].
1.2.5.2. Cấu tạo chính của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
Cấu tạo của một máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) gồm các bộ phận chính sau: Nguồn bức xạ, bộ phận hóa hơi hay nguyên tử hóa mẫu, bộ phận đơn sắc hóa, bộ phận phát hiện và khuếch đại tín hiệu.
- Nguồn phát tia bức xạ cộng hƣởng của nguyên tố cần phân tích: thƣờng là đèn cathod rỗng HCL (Hollow Cathode Lamp) hoặc đèn phóng điện không cực EDL (Electronic Discharge Lamp) hoặc đèn phổ liên tục có biến điệu.
- Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích, có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu:
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa F-AAS (Flame AAS), sử dụng khí C2H2 và không khí nén hoặc dinitơ oxid (N2O).
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa ETA-AAS (Electro -Thermal- Atomization AAS): kỹ thuật này thực hiện quá trình nguyên tử hóa mẫu trong thời gian rất ngắn nhờ vào năng lƣợng của dòng điện có công suất lớn và trong môi trƣờng khí trơ.
- Bộ đơn sắc hóa thƣờng đặt sau bộ phận nguyên tử hóa mẫu với mục đích chọn vạch cộng hƣởng từ nguồn bức xạ nhiều vạch và loại bỏ nh ng vạch nhiễu do chính ngọn lửa phát ra.
- 18 -
1.2.5.3. Phương pháp AAS với kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa
Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa là dùng năng lƣợng của ngọn lửa đèn khí để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích.
Để tạo ra ngọn lửa, có thể đốt cháy nhiều hỗn hợp khí khác nhau trong các đèn khí thích hợp bao gồm một khí oxy hóa và một khí cháy. Các hỗn hợp khí đƣợc dùng phải đảm bảo các yêu cầu nhất định để dùng vào mục đích hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích. Các hỗn hợp khí đƣợc dùng nhiều nhất trong phép đo F-AAS là: acetylen và không khí nén, N2O và acetylen hay hydro và acetylen [15]
Các quá trình xảy ra trong ngọn lửa:
Trong ngọn lửa có nhiều quá trình đồng thời xảy ra, có quá trình chính và cũng có quá trình phụ. Trong đó, nhiệt độ của ngọn lửa là yếu tố quyết định mọi diễn biến của các quá trình đó.
Trƣớc hết, khi mẫu ở thể sol khí đƣợc dẫn lên đèn nguyên tử hóa, dƣới tác dụng nhiệt của ngọn lửa, ở miệng đèn, là sự bay hơi của dung môi hòa tan và các chất h u cơ trong thể sol khí. Mẫu còn lại là các hạt rắn rất nhỏ mịn (các muối của các chất) trong ngọn lửa và nó đƣợc dẫn tiếp vào vùng trung tâm ngọn lửa. Tiếp đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa của các hạt mẫu khô. Các quá trình này xảy ra thƣờng theo hai cơ chế chính:
- Nếu Eh < En tức năng lƣợng hóa hơi Eh của các hợp phần có trong mẫu nhỏ hơn năng lƣợng nguyên tử hóa En của nó thì trƣớc hết các hợp phần này sẽ hóa hơi ở dạng phân tử. Sau đó các phân tử này mới bị phân ly thành các nguyên tử tự do:
MnAm (L) → MnAm (K) → nM0(K) + mA(K). M0(K) + n(hv) → phổ AAS.
- Nếu Eh > En tức năng lƣợng phân ly Eh của các hợp phần của mẫu nhỏ hơn năng lƣợng hóa hơi Eh thì trƣớc hết các hợp phần đó sẽ bị phân ly thành các nguyên tử tự do rồi sau đó mới hóa hơi:
nMnAm(L) → nM(R,L) + mA(L,R) → nM0
(K). M0(K) + n(hv) → phổ AAS
- 19 -
Bên cạnh các quá trình chính, trong ngọn lửa đèn khí còn một số quá trình phụ (sự ion hóa của nguyên tố phân tích, sự phát xạ, sự hấp thụ của phân tử, sự tạo thành hợp chất bền nhiệt).
1.2.6. Các phƣơng pháp định lƣợng bạc
- Dùng phương pháp chuẩn độ: [2]
Phƣơng pháp này chỉ áp dụng cho các trƣờng hợp lƣợng bạc đủ lớn để có thể phát hiện sự thay đổi về màu sắc hay điện thế.
+ Phƣơng pháp Mohr: Cho muối bạc nitrat phản ứng với natri clorid, chỉ thị là Kali cromat, khi tới gần điểm tƣơng đƣơng một lƣợng dƣ Ag+
phản ứng với CrO42- tạo ra kết tủa đỏ gạch Ag2CrO4.
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ (trắng). 2Ag+ + CrO42- → Ag2CrO4 (đỏ gạch)
+ Cho muối bạc phản ứng với natri clorid trong môi trƣờng acid, điểm tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp đo thế.
+ Phƣơng pháp Volhard: Cho muối bạc nitrat dƣ phản ứng với natri clorid trong môi trƣờng acid, định lƣợng muối bạc dƣ bằng dung dịch KSCN với chỉ thị phèn sắt amon và thêm một lƣợng nhỏ nitrobenzen:
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ Ag+ + SCN- → AgSCN ↓ Fe3+ + SCN- → Fe(SCN)2+ (màu đỏ)
+ Phƣơng pháp Fajans: Cho muối bạc nitrat phản ứng với natri clorid, chỉ thị fluorescein, gần điểm tƣơng đƣơng dung dịch từ màu vàng chuyển sang màu hồng:
Ag+ + Cl- → AgCl ↓ HFlu ↔ H+ + Flu-
Trƣớc điểm tƣơng đƣơng, lƣợng AgNO3 cho vào còn thiếu nên tủa tạo thành hấp phụ Cl-
dƣ trong dung dịch, vì vậy các hạt kết tủa mang điện tích âm. Sau điểm tƣơng đƣơng, Ag+
- 20 -
dƣơng sẽ hấp phụ anion Flu- của chỉ thị, làm nó chuyển từ màu vàng sang màu hồng. Sự chuyển màu này giúp ta phát hiện điểm kết thúc của chuẩn độ.
+ Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp hóa học định tính, định lƣợng bạc: - Các phép định tính chỉ phát hiện đƣợc bạc ở dạng ion.
- Yêu cầu một lƣợng mẫu lớn.
- Độ chính xác và độ nhạy không cao khi phân tích mẫu chỉ chứa bạc ở dạng vi lƣợng.
1.3. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA NANO BẠC BẠC
Phƣơng pháp tiếp xúc đƣợc sử dụng trong đánh giá tác dụng diệt khuẩn nano bạc
1.3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc của phƣơng pháp là cấy một hỗn dịch vi sinh vật chỉ thị thích hợp vào chế phẩm cần thử, tốt nhất là cấy trực tiếp vào bao bì đóng gói cuối cùng của sản phẩm, nếu có thể. Ủ chế phẩm đã cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp, sau đó lấy mẫu và đếm số lƣợng vi sinh vật sống còn lại trong sản phẩm sau khoảng thời gian ủ nhất định. [6]
1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý và khả năng gây bệnh của một số loài VSV dùng trong nghiên cứu [4] [8] dùng trong nghiên cứu [4] [8]
Phƣơng pháp tiếp xúc sử dụng 5 loài VSV chỉ thị bao gồm:
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Streptococcus mutans ATCC 700610
- Streptococcus sanguinis ATCC 10556 - Candida albicans ATCC 10231
- 21 -
- Đặc điểm hình thái: là VSV Eucaryote, cơ thể là nh ng tế bào nhỏ hình trứng, có khi có chồi nhỏ.
- Sinh sản: vô tính bằng cách nảy chồi, h u tính bằng cách hình thành túi bào tử.
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Môi trƣờng Sabouraud là môi trƣờng nuôi cấy cơ bản. Điều kiện thích hợp là: pH = 5,8-6,2; nhiệt độ = 25-28°C.
+ Môi trƣờng Sabouraud lỏng: tạo váng trên bề mặt;
+ Môi trƣờng Sabouraud đặc: khuẩn lạc to, nhẵn, màu trắng đục.
- Khả năng gây bệnh: là nấm men ký sinh trong ống tiêu hóa, gặp điều kiện thuận lợi có thể gây bệnh nhƣ: tƣa lƣỡi ở trẻ em, viêm thực quản, viêm da, viêm âm đạo,…
1.3.2.2. Streptococcus mutans
Cho đến nay Streptococcus mutans đƣợc xem là tác nhân chính gây ra sâu răng. Vi khuẩn này lên men carbohydrate tạo ra acid, làm pH giảm xuống < 5, sự giảm pH liên tục có thể đƣa đến sự khử khoáng trên bề mặt răng, làm mất vôi ở các mô cứng của răng, khởi phát quá trình sâu răng.
Cơ chế chính xác để S.mutans bám dính và tích tụ trên bề mặt thì chƣa rõ nhƣng S.mutans đƣợc nghĩ là yếu tố gây bệnh vì chúng có khả năng tạo glucans ngoại bào từ sucrose. Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có thể tổng hợp polysaccharide nhƣ glucans hoặc destrans lại không thể gây sang thƣơng sâu răng. Có lẽ có nh ng yếu tố khác ảnh hƣởng đến độc lực của S.mutans. Ngƣời ta nhận thấy, S.mutans
chứa nh ng phân tử polypeptide có thể tạo liên kết đồng hóa trị, đó có thể là phƣơng tiện để vi khuẩn bám dính vào bề mặt răng.
1.3.2.3. Streptococcus sanguinis
Streptococcus sanguinis là một chủng vi khuẩn Gram (+). Chủng vi khuẩn này có khả năng hô hấp, sản xuất và chống chịu với H2O2. Chủng vi khuẩn này cũng có hoạt tính các enzyme NADH oxidase và superoxide dismutase cao, gợi ý
- 22 -
rằng chính các enzyme này ñã tham gia vào quá trình bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi tổn thƣơng do axit và H2O2.
1.3.2.4. Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh)
- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-),có một lông ở một đầu, không sinh nha bào.
- Hô hấp: hiếu khí tuyệt đối;
- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, thích hợp nhất ở pH = 7,2-7,5; nhiệt độ = 37°C.
+ Môi trƣờng canh thang: tạo váng trên bề mặt;
+ Môi trƣờng thạch thƣờng: khuẩn lạc nhỏ, màu xanh, bề mặt nhẵn hoặc xù xì.
- Tính chất đặc trƣng: có khả năng sinh 2 loại sắc tố là fluorescin (có màu xanh vàng) và pyocyanin (có màu xanh lục nhạt).
- Khả năng gây bệnh: là nguyên nhân của nh ng bệnh nhiễm trùng cơ hội. Tại nơi nhiễm trùng chúng gây ra tổn thƣơng có mủ màu xanh. Gặp điều kiện thuận lợi, có thể gây nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, viêm màng não…
1.3.2.5. Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng)
- Đặc điểm hình thái : cầu khuẩn Gram (+) mọc thành từng đám, không hình thành