2.2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
Các đối tượng nghiên cứu được thu thập số liệu nghiên cứu theo mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất.
Các chỉ số nghiên cứu: - Tuổi, giới.
- Các số triệu chứng lâm sàng: mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, vàng da, vàng mắt, gan to, đau tức hạ sườn phải.
- Các dấu ấn huyết thanh: HBsAg, HBeAg, HBV-DNA. - Các chỉ số hóa sinh máu: AST, ALT.
Tiến hành lấy số liệu từ hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán, điều trị lưu lại tại viện.
2.2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Máu của các đối tượng nghiên cứu được lấy vào buổi sáng, lúc đói, chống đông phù hợp (định lượng HBV-DNA sử dụng chống đông EDTA, xét nghiệm sinh hóa máu sử dụng chống đông heparin), sau đó ly tâm, hút lấy huyết tương tiến hành làm xét nghiệm:
- Test nhanh HBsAg: xác định sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg trong máu người nhằm mục đích chẩn đoán lây nhiễm viêm gan virus B. Sử dụng kit thử của công ty cổ phần Á Châu.
Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán viêm gan virus B (HBsAg) là dụng cụ xét
nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên virus viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa với các kháng thể kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong những trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vạch chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.
- Xét nghiệm HBeAg: kháng nguyên này xuất hiện trong máu khi HBV nhân lên. Sử dụng kỹ thuật ELISA với máy xét nghiệm miễn dịch Biorad iMark, kit Diagnostic automation.
Nguyên lý kỹ thuật [14]: Kỹ thuật được tiến hành theo nguyên lý
do kết quả xét nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của 2 loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (ditection antibodies). Kỹ thuật này được phân làm 2 loại là Direct sandwich ELISA (Sandwich ELISA trực tiếp) và Indirect sandwich ELISA (Sandwich ELISA gián tiếp).
Sandwich ELISA trực tiếp [14]:
Cho kháng thể vào mỗi giếng ELISA ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm kháng nguyên vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu ↓
Ủ, đọc kết quả
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn những phương pháp khác mà chúng tôi lựa chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh về virus trong nghiên cứu.
Sandwich ELISA gián tiếp [14]:
Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng nguyên ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng thể thứ II ↓ Ủ, rửa ↓
Bổ sung kháng thể thứ II có gắn enzym vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu
- HBV-DNA: định lượng nồng độ virus. Acid nhân của virus viêm gan
B (HBV-DNA) được tách bằng kit tách của công ty cổ phần Việt Á. Phương pháp định lượng virus được thực hiện trên máy realtime PCR Eppendorf reaplex 4.
Phương pháp realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong realtime PCR người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi để phát huỳnh quang và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang. Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ đặc biệt được gắn với một module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Thành phần phản ứng:
Dung dịch đệm (Buffer), dNTPs, Taq DNA Polymerase, mồi (primer), Mg2+…và chất phát huỳnh quang.
Kết quả được chia ra 3 mức [8]:
- HBV-DNA < 102 copies/mL: virus hoạt động mức độ thấp.
- HBV-DNA từ 102-105 copies/mL: virus hoạt động mức độ trung bình. - HBV-DNA >105 copies/mL: virus hoạt động mức độ cao.
Xét nghiệm định lượng nồng độ HBV-DNA được làm tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử -Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
Các xét nghiệm hóa sinh máu: thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương với kỹ thuật định lượng AST, ALT. Các xét nghiệm được tiến hành trên máy hóa sinh tự động AU 400, sử dụng hóa chất của Beck man coulter.
Nguyên lý:
- Hoạt độ AST [2]: Xác định hoạt độ của AST bằng phương pháp động học.
Oxaloacetat + NADH + H+ L-malat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của AST huyết tương bình thường là < 40 U/L.
- Hoạt độ ALT [2]: Xác định hoạt độ của ALT bằng phương pháp động học.
L-alanin + α-cetoglutarat pyruvat + L-glutamat Pyruvat + NADH + H+ L-lactat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của ALT huyết tương bình thường là < 37 U/L.