1.4.2.1 Nguyên lý chung
Phương pháp Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong Realtime PCR người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi để phát huỳnh quang và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang. Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ đặc biệt được gắn với một module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
1.4.2.2 Các thành phần trong phản ứng realtime PCR
Cũng giống như phản ứng PCR thành phần của phản ứng Realtime PCR cũng bao gồm như sau: Dung dịch đệm (Buffer), dNTPs, Taq DNA Polymerase, mồi (primer), Mg2+…và chất phát huỳnh quang.
Trong phản ứng Realtime PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide,
SYBR Green, EvaGreen…) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX…).
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện
diện của DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn. Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp, nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy.
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của tác nhân liên kết với mạch đôi DNA Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu: Rất đa dạng như FAM,
TARMA, Texas Red, Cy3, Cy5…được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như Taqman probe, Beacon probe, probe lai.
Probe được dịch là đoạn dò hay dò, đó là những đoạn oligonucleotit sợi đơn có một trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên đoạn DNA khuôn. Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt gặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại và khi có sự
bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime sử dụng Taqman probe.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn, do vậy mà huỳnh quang phát ra từ repoter từ đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì taqman probe sẽ bắt cặp với sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Enzym taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp thành sợi bổ sung, do vậy repoter của probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang
lượng repoter tự do ngày càng nhiều và đến một lúc cường độ huỳnh quang phát ra từ repoter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime PCR sử dụng beacon probe
Beacon probe là probe có trình tự dài khoảng 25-40 base, có đầu 5’ gắn với repoter và đầu 3’ gắn với quencher. Beacon probe có trình tự ở giữa dài khoảng 15-39 base bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên sợi DNA khuôn, còn hai đầu của probe có trình tự khoảng 5-6 base bổ sung với nhau làm cho probe có cấu trúc hình kẹp tóc.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của Beacon probe
Ở giai đoạn nhiệt độ biến tính, cấu trúc kẹp tóc của beacon probe không còn, nên nếu ở giai đoạn này repoter nhận được nguồn sáng kích thích thì nó sẽ phát huỳnh quang.
Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì cấu trúc kẹp tóc của hai đầu probe đã làm cho repoter gần với quencher nên tất cả huỳnh quang phát ra từ repoter đều bị quencher hấp phụ. Nhưng khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, beacon probe sẽ bắt
cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi DNA đích của sản phẩm khuếch đại làm cho repoter cách xa quencher nên repoter phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, enzym taq DNA polymerase không thủy giải beacon probe mà chỉ tách probe ra khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, beacon probe tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho repoter phát tín hiệu huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime PCR sử dụng probe lai
Trong kỹ thuật này, người ta sử dụng hai probe lai: Probe lai 1 có đầu 3’ có gắn một chất phát huỳnh quang D (Donor) và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một chất phát huỳnh quang A (Accepter). Để tránh không cho probe lai 2 này có thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 2 gắp thêm một gốc phosphat.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.6. Cơ chế hoạy động của Probe lai
Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì D của probe lai 1 phát huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích thích nhưng thiết bị realtime không ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang này vì ánh sáng phát ra từ D không qua được kính lọc để đến CCD camera hay cảm quang. Nếu có sản phẩm khuếch đại hiện diện thì probe lai 1 và probe lai 2 gắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cho A phát huỳnh quang và thiết bị realtime sẽ ghi nhận được huỳnh quang này nếu lượng sản phẩm khuếch đại đạt đủ ngưỡng để huỳnh quang phát ra từ A qua được kính lọc đến CCD camera hay cảm quang của thiết bị realtime.
1.4.2.3 Ứng dụng của Realtime PCR [24]
- Định lượng tuyệt đối:
Ví dụ: Copies/mL của HBV, HCV, HIV trong máu so với mẫu chuẩn. - Định lượng tương đối:
+ Xác định biến đổi gen của sản phẩm nông nghiệp thủy sản. + Định lượng biểu hiện gen P53 cản trở ung thư…
- Xác định genotype, đột biến kháng thuốc HBV, HCV, đột biến precore, core promotor HBV, định danh nấm, vi khuẩn và kháng thuốc.
CHƯƠNG 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn tính và điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
2.1.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: tháng 7/2014 đến 5/2015
- Địa điểm: bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Theo quyết định số 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 của Bộ trưởng Bộ Y tế về chẩn đoán xác định viêm gan virus B mạn tính như sau:
- HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc-IgG (+). - AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng.
- Có bằng chứng tổn thương mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xác định bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan hoặc Fibrotest hoặc chỉ số APRI) mà không do căn nguyên khác.
2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ
Loại trừ các bệnh nhân có đặc điểm sau: - Bệnh nhân < 15 tuổi.
- Có anti HAV-IgM dương tính, anti HCV dương tính hoặc đồng nhiễm HIV.
- Viêm gan do rượu, viêm gan do thuốc. - Đã có dấu hiệu xơ gan hoặc ung thư gan. - Phụ nữ có thai.
- Bệnh nhân đang mắc bệnh kết hợp như: sốt rét, tiểu đường, viêm đường mật, tăng huyết áp…
- Bệnh nhân bị bệnh về máu.
- Bênh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp với nghiên cứu hồi cứu.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu và cách chọn mẫu
- Cỡ mẫu: Toàn bộ bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn tính điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương (N=38).
- Cách chọn mẫu:
+ Liên hệ thực tế và tiến hành nghiên cứu ngang bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lập danh sách toàn bộ bệnh nhân nhiễm viêm gan virus B bao gồm thông tin về: họ tên, tuổi, giới, địa chỉ liên hệ.
2.2.3. Kỹ thuật thu thập số liệu
2.2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
Các đối tượng nghiên cứu được thu thập số liệu nghiên cứu theo mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất.
Các chỉ số nghiên cứu: - Tuổi, giới.
- Các số triệu chứng lâm sàng: mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, vàng da, vàng mắt, gan to, đau tức hạ sườn phải.
- Các dấu ấn huyết thanh: HBsAg, HBeAg, HBV-DNA. - Các chỉ số hóa sinh máu: AST, ALT.
Tiến hành lấy số liệu từ hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán, điều trị lưu lại tại viện.
2.2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Máu của các đối tượng nghiên cứu được lấy vào buổi sáng, lúc đói, chống đông phù hợp (định lượng HBV-DNA sử dụng chống đông EDTA, xét nghiệm sinh hóa máu sử dụng chống đông heparin), sau đó ly tâm, hút lấy huyết tương tiến hành làm xét nghiệm:
- Test nhanh HBsAg: xác định sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg trong máu người nhằm mục đích chẩn đoán lây nhiễm viêm gan virus B. Sử dụng kit thử của công ty cổ phần Á Châu.
Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán viêm gan virus B (HBsAg) là dụng cụ xét
nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên virus viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa với các kháng thể kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong những trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vạch chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.
- Xét nghiệm HBeAg: kháng nguyên này xuất hiện trong máu khi HBV nhân lên. Sử dụng kỹ thuật ELISA với máy xét nghiệm miễn dịch Biorad iMark, kit Diagnostic automation.
Nguyên lý kỹ thuật [14]: Kỹ thuật được tiến hành theo nguyên lý
do kết quả xét nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của 2 loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (ditection antibodies). Kỹ thuật này được phân làm 2 loại là Direct sandwich ELISA (Sandwich ELISA trực tiếp) và Indirect sandwich ELISA (Sandwich ELISA gián tiếp).
Sandwich ELISA trực tiếp [14]:
Cho kháng thể vào mỗi giếng ELISA ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm kháng nguyên vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu ↓
Ủ, đọc kết quả
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn những phương pháp khác mà chúng tôi lựa chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh về virus trong nghiên cứu.
Sandwich ELISA gián tiếp [14]:
Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng nguyên ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng thể thứ II ↓ Ủ, rửa ↓
Bổ sung kháng thể thứ II có gắn enzym vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- HBV-DNA: định lượng nồng độ virus. Acid nhân của virus viêm gan
B (HBV-DNA) được tách bằng kit tách của công ty cổ phần Việt Á. Phương pháp định lượng virus được thực hiện trên máy realtime PCR Eppendorf reaplex 4.
Phương pháp realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong realtime PCR người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi để phát huỳnh quang và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang. Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ đặc biệt được gắn với một module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Thành phần phản ứng:
Dung dịch đệm (Buffer), dNTPs, Taq DNA Polymerase, mồi (primer), Mg2+…và chất phát huỳnh quang.
Kết quả được chia ra 3 mức [8]:
- HBV-DNA < 102 copies/mL: virus hoạt động mức độ thấp.
- HBV-DNA từ 102-105 copies/mL: virus hoạt động mức độ trung bình. - HBV-DNA >105 copies/mL: virus hoạt động mức độ cao.
Xét nghiệm định lượng nồng độ HBV-DNA được làm tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử -Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
Các xét nghiệm hóa sinh máu: thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương với kỹ thuật định lượng AST, ALT. Các xét nghiệm được tiến hành trên máy hóa sinh tự động AU 400, sử dụng hóa chất của Beck man coulter.
Nguyên lý:
- Hoạt độ AST [2]: Xác định hoạt độ của AST bằng phương pháp động học.
Oxaloacetat + NADH + H+ L-malat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của AST huyết tương bình thường là < 40 U/L.
- Hoạt độ ALT [2]: Xác định hoạt độ của ALT bằng phương pháp động học.
L-alanin + α-cetoglutarat pyruvat + L-glutamat Pyruvat + NADH + H+ L-lactat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của ALT huyết tương bình thường là < 37 U/L.
2.2.4. Biện pháp hạn chế sai số
- Đảm bảo sự thống nhất trong quá trình nghiên cứu của mình về quy trình và phương pháp thu thập số liệu phải giống nhau.
- Chọn được đối tượng nghiên cứu và thiết kế nghiên cứu phù hợp. - Sử dụng quy trình chẩn đoán, theo dõi và đánh giá giống nhau.
- Chuẩn hóa và sử dụng thống nhất các công cụ đo lường có độ chính xác cao.
2.2.5. Xử lý và phân tích số liệu
Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học.
Kết quả được phân tích và xử lý trên máy tính theo phần mềm SPSS 16.0. Giá trị p < 0,05 trong các so sánh được coi là có ý nghĩa thống kê.
2.2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Giữ bí mật về sơ yếu lý lịch, tình trạng bệnh tật của bệnh nhân. - Tiến hành nghiên cứu một cách trung thực và nghiêm túc. - Đối tượng nghiên cứu được thông báo về mục đích nghiên cứu.