2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp với nghiên cứu hồi cứu.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu và cách chọn mẫu
- Cỡ mẫu: Toàn bộ bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn tính điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương (N=38).
- Cách chọn mẫu:
+ Liên hệ thực tế và tiến hành nghiên cứu ngang bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B.
+ Lập danh sách toàn bộ bệnh nhân nhiễm viêm gan virus B bao gồm thông tin về: họ tên, tuổi, giới, địa chỉ liên hệ.
2.2.3. Kỹ thuật thu thập số liệu
2.2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
Các đối tượng nghiên cứu được thu thập số liệu nghiên cứu theo mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất.
Các chỉ số nghiên cứu: - Tuổi, giới.
- Các số triệu chứng lâm sàng: mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, vàng da, vàng mắt, gan to, đau tức hạ sườn phải.
- Các dấu ấn huyết thanh: HBsAg, HBeAg, HBV-DNA. - Các chỉ số hóa sinh máu: AST, ALT.
Tiến hành lấy số liệu từ hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán, điều trị lưu lại tại viện.
2.2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Máu của các đối tượng nghiên cứu được lấy vào buổi sáng, lúc đói, chống đông phù hợp (định lượng HBV-DNA sử dụng chống đông EDTA, xét nghiệm sinh hóa máu sử dụng chống đông heparin), sau đó ly tâm, hút lấy huyết tương tiến hành làm xét nghiệm:
- Test nhanh HBsAg: xác định sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg trong máu người nhằm mục đích chẩn đoán lây nhiễm viêm gan virus B. Sử dụng kit thử của công ty cổ phần Á Châu.
Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán viêm gan virus B (HBsAg) là dụng cụ xét
nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên virus viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa với các kháng thể kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong những trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vạch chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.
- Xét nghiệm HBeAg: kháng nguyên này xuất hiện trong máu khi HBV nhân lên. Sử dụng kỹ thuật ELISA với máy xét nghiệm miễn dịch Biorad iMark, kit Diagnostic automation.
Nguyên lý kỹ thuật [14]: Kỹ thuật được tiến hành theo nguyên lý
do kết quả xét nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của 2 loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (ditection antibodies). Kỹ thuật này được phân làm 2 loại là Direct sandwich ELISA (Sandwich ELISA trực tiếp) và Indirect sandwich ELISA (Sandwich ELISA gián tiếp).
Sandwich ELISA trực tiếp [14]:
Cho kháng thể vào mỗi giếng ELISA ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm kháng nguyên vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu ↓
Ủ, đọc kết quả
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn những phương pháp khác mà chúng tôi lựa chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh về virus trong nghiên cứu.
Sandwich ELISA gián tiếp [14]:
Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng nguyên ↓ Ủ, rửa ↓ Thêm kháng thể thứ II ↓ Ủ, rửa ↓
Bổ sung kháng thể thứ II có gắn enzym vào ↓
Ủ, rửa ↓
Thêm cơ chất tạo màu
- HBV-DNA: định lượng nồng độ virus. Acid nhân của virus viêm gan
B (HBV-DNA) được tách bằng kit tách của công ty cổ phần Việt Á. Phương pháp định lượng virus được thực hiện trên máy realtime PCR Eppendorf reaplex 4.
Phương pháp realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong realtime PCR người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi để phát huỳnh quang và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang. Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ đặc biệt được gắn với một module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Thành phần phản ứng:
Dung dịch đệm (Buffer), dNTPs, Taq DNA Polymerase, mồi (primer), Mg2+…và chất phát huỳnh quang.
Kết quả được chia ra 3 mức [8]:
- HBV-DNA < 102 copies/mL: virus hoạt động mức độ thấp.
- HBV-DNA từ 102-105 copies/mL: virus hoạt động mức độ trung bình. - HBV-DNA >105 copies/mL: virus hoạt động mức độ cao.
Xét nghiệm định lượng nồng độ HBV-DNA được làm tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử -Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
Các xét nghiệm hóa sinh máu: thực hiện tại phòng xét nghiệm bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương với kỹ thuật định lượng AST, ALT. Các xét nghiệm được tiến hành trên máy hóa sinh tự động AU 400, sử dụng hóa chất của Beck man coulter.
Nguyên lý:
- Hoạt độ AST [2]: Xác định hoạt độ của AST bằng phương pháp động học.
Oxaloacetat + NADH + H+ L-malat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của AST huyết tương bình thường là < 40 U/L.
- Hoạt độ ALT [2]: Xác định hoạt độ của ALT bằng phương pháp động học.
L-alanin + α-cetoglutarat pyruvat + L-glutamat Pyruvat + NADH + H+ L-lactat + NAD+
Đo độ giảm của NADH+ ở bước sóng 340nm tính được hoạt độ của AST. Giá trị tham khảo của ALT huyết tương bình thường là < 37 U/L.
2.2.4. Biện pháp hạn chế sai số
- Đảm bảo sự thống nhất trong quá trình nghiên cứu của mình về quy trình và phương pháp thu thập số liệu phải giống nhau.
- Chọn được đối tượng nghiên cứu và thiết kế nghiên cứu phù hợp. - Sử dụng quy trình chẩn đoán, theo dõi và đánh giá giống nhau.
- Chuẩn hóa và sử dụng thống nhất các công cụ đo lường có độ chính xác cao.
2.2.5. Xử lý và phân tích số liệu
Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học.
Kết quả được phân tích và xử lý trên máy tính theo phần mềm SPSS 16.0. Giá trị p < 0,05 trong các so sánh được coi là có ý nghĩa thống kê.
2.2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Giữ bí mật về sơ yếu lý lịch, tình trạng bệnh tật của bệnh nhân. - Tiến hành nghiên cứu một cách trung thực và nghiêm túc. - Đối tượng nghiên cứu được thông báo về mục đích nghiên cứu. - Kết quả nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của các đối tượng ngiên cứu
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng theo giới
Giới Số trường hợp (n) Tỷ lệ (%)
Nam 23 60,5
Nữ 15 39,5
Tổng 38 100
Nhận xét: Tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 60,5% nhiều hơn nữ (39,5%). Bảng 3.2. Phân bố đối tượng theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi Số trường hợp Tỷ lệ (%) 20-29 14 36,8 30-39 9 23,7 40-49 8 21,1 >50 7 18,4 Tổng 38 100 Tuổi trung bình 35,6 ±11,7 Nhận xét:
- Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân nghiên cứu là 35,6 ±11,7. - Nhóm tuổi có tỷ lệ gặp nhiều nhất là 20-29 tuổi chiếm 36,8%. - Nhóm tuổi có tỷ lệ gặp ít nhất là > 50 tuổi chiếm 18,4%.
Bảng 3.3. Một số triệu chứng lâm sàng của đối tượng nghiên cứu Triệu chứng lâm sàng Số trường hợp (n) Tỷ lệ (%)
Mệt mỏi 36 94,7
Chán ăn 37 97,4
Buồn nôn hoặc nôn 25 65,8
Vàng da, vàng mắt 17 44,7
Tiểu vàng 17 44,7
Đau tức hạ sườn phải 23 60,5
Gan to 5 13,2
Nhận xét: Hầu hết bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính đều có các triệu chứng không điển hình như mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn hoặc nôn, đau tức hạ sườn phải chiếm tỷ lệ cao 94,7%; 97,4%; 65,8% và 60,5%.
3.2. Các dấu hiệu chỉ điểm sự nhân lên của virus viêm gan B ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính. viêm gan virus B mạn tính.
Bảng 3.4. Tỷ lệ HBeAg (+) và HBeAg (-) theo giới HBeAg Giới HBeAg (+) HBeAg (-) P n % N % Nam (n=23) 8 42,1 15 78,9 < 0,05 Nữ (n=15) 11 57,9 4 21,1 Tổng (n=38) 19 100 19 100
Nhận xét: Nhóm bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính có HBeAg (+) và HBeAg (-) chiếm tỷ lệ bằng nhau là 50%.
- Ở nhóm HBeAg (-), nam chiếm tỷ lệ 78,9% cao hơn nhiều so với nữ là 21,1%.
- Sự khác biệt về tỷ lệ HBeAg (+) và HBeAg (-) theo giới có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Bảng 3.5. Tỷ lệ HBeAg (+) và HBeAg (-) theo nhóm tuổi HBeAg Nhóm tuổi HBeAg (+) HBeAg (-) P n % N % 20-29 (n=14) 10 52,6 4 21,1 < 0,05 30-39 (n=9) 6 31,6 3 15,8 40-49 (n=8) 3 15,8 5 26,3 >50 (n=7) 0 0 7 36,8 Trung bình 29,7 ± 8,6 41,5 ± 11,7 Nhận xét:
Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân có HBeAg (+) và HBeAg (-) lần lượt là 29,7 ± 8,6 và 41,5 ± 11,7.
Ở nhóm bệnh nhân có HBeAg (+): nhóm tuổi có tỷ lệ gặp nhiều nhất là (20-29) tuổi chiếm 52,6% rồi đến (30-39), (40-49) chiếm 31,6%, 15,8%. Không có bệnh nhân nào >50 tuổi.
Ở nhóm bệnh nhân có HBeAg (-): nhóm tuổi có tỷ lệ gặp nhiều nhất là >50 tuổi chiếm 36,8% rồi đến nhóm tuổi (40-49), (20-29) chiếm tỷ lệ 26,3%, 21,1%. Nhóm tuổi có tỷ lệ gặp ít nhất là (30-39) chiếm 15,8%.
Sự khác biệt về tỷ lệ HBeAg (+) và HbeAg (-) theo nhóm tuổi có ý nghĩa thống kê với p <0,05.
Bảng 3.6. Tỷ lệ HBV-DNA phân bố theo nồng độ Nồng độ HBV-DNA Số bệnh nhân (n) Tỷ lệ (%) <102 copies/mL 9 23,7 102-105 copies/mL 7 18,4 > 105 copies/mL 22 57,9 Tổng 38 100
Nhận xét: Số bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA >105 copies/mL chiếm tỷ lệ cao nhất là 57,9%, sau đó là < 102 copies/mL chiếm 23,7%. Số bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA từ 102-105 copies/mL chiếm tỷ lệ thấp nhất là 18,4%.
Bảng 3.7. Nồng độ HBV-DNA theo giới
Giới
Nồng độ HBV-DNA
Tổng <102 copies/mL 102-105 copies/mL >105 copies/mL
n % n % n % n %
Nam 6 26,1 6 26,1 11 47,8 23 100
Nữ 3 20,0 1 6,7 11 73,3 15 100
P > 0,05 100 100
Nhận xét: Về đánh giá nồng độ HBV-DNA trong máu bệnh nhân mắc viêm
gan mạn tính không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai giới nam và nữ (p > 0,05).
Bảng 3.8. Nồng độ HBV-DNA theo nhóm tuổi Nhóm
tuổi
Nồng độ HBV-DNA
P <102 copies/mL 102-105 copies/mL >105 copies/mL
n % n % n % 20-29 2 22,2 1 14,3 11 50 > 0,05 30-39 2 22,2 1 14,3 6 27,3 40-49 3 33,4 3 42,9 2 9,1 >50 2 22,2 2 28,6 3 13,6 Tổng 9 100 7 100 22 100 Nhận xét:
- Ở nhóm có nồng độ HBV-DNA <102 copies/mL: tỷ lệ bệnh nhân có độ tuổi từ (40-49) chiếm 33,4% cao hơn cả 3 nhóm bệnh nhân có độ tuổi (20-29), (30-39) và >50 (22,2%).
- Ở nhóm có nồng độ HBV-DNA 102 -105 copies/mL: nhóm bệnh nhân có độ tuổi (40-49) chiếm tỷ lệ cao nhất là 42,9% sau đó là độ tuổi > 50 chiếm 28,6% rồi đến độ tuổi (20-29), (30-39) đều chiếm 14,3%.
- Ở nhóm có nồng độ HBV-DNA >105 copies/mL: nhóm bệnh nhân có độ tuổi (20-29) chiếm tỷ lệ cao nhất là 50% rồi đến (30-39), >50 chiếm 27,3%, 13,6%. Nhóm bệnh nhân có độ tuổi (40-49) chiếm tỷ lệ thấp nhất là 9,1%.
- Sự khác biệt về nồng độ HBV-DNA giữa các nhóm tuổi không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Bảng 3.9. Hoạt độ Transaminase (AST, ALT) trung bình của đối tượng nghiên cứu
Nhóm tuổi Hoạt độ Transaminase trung bình (U/L)
AST ALT 20-29 30,1 ± 18,0 34,7 ± 32,9 30-39 30,6 ± 9,3 33,2 ± 13,5 40-49 41,6 ± 27,2 65,0 ± 46,1 >50 48,9 ± 17,0 49,6 ± 20,2 Trung bình 36,1 ± 19,4 43,5 ± 32,4 P > 0,05 > 0,05 Nhận xét:
- Hoạt độ AST trung bình cao nhất ở nhóm tuổi >50 là 48,9 ± 17,0 U/L và thấp nhất ở nhóm tuổi (20-29) là 30,1 ± 18,0 U/L.
- Hoạt độ ALT trung bình cao nhất ở nhóm tuổi (40-49) là 65,0 ± 46,1 U/L và tháp nhất ở nhóm tuổi (30-39) là 33,2 ± 13,5 U/L.
- Sự khác biệt về hoạt độ Transaminase trung bình theo nhóm tuổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
3.3. Mối liên quan giữa HBeAg, HBV-DNA với một số đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính. ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính.
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa HBeAg với hoạt độ Transaminase trung bình Hoạt độ Transaminase trung bình (U/L) HbeAg p HBeAg (+) HBeAg (-) AST 36,0 ± 23,1 36,2 ± 15,6 > 0,05 ALT 47,6 ± 42,1 39,3 ± 18,6 > 0,05 Nhận xét:
- Hoạt độ AST trung bình ở nhóm có HBeAg (+) là 36,0 ± 23,1 U/L thấp hơn ở nhóm HBeAg (-) là 36,2 ± 15,6U/L.
- Hoạt độ ALT trung bình ở nhóm có HBeAg (+) là 47,6 ± 42,1 U/L cao hơn nhóm có HBeAg (-) là 39,3 ± 18,6 U/L.
- Sự khác biệt giữa hoạt độ Transaminase trung bình với HBeAg không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa HBV-DNA với hoạt độ Transaminase trung bình Hoạt độ Transaminase trung bình (U/L) Nồng độ HBV-DNA p <102 copies/mL 102-105 copies/mL >105 copies/mL AST 27,2 ± 7,0 43,4 ± 8,1 37,4 ± 24,0 > 0,05 ALT 33,9 ± 15,6 70,0 ± 39,4 38,9 ± 31,9 > 0,05
Nhận xét: Hoạt độ Transaminase trung bình thấp nhất ở nhóm có nồng độ HBV-DNA <102 copies/mL, cao nhất ở nhóm có nồng độ HBV-DNA từ 102-105 copies/mL. Sự khác biệt giữa nồng độ HBV-DNA với hoạt dộ Transaminase trung bình không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa HBeAg và HBV-DNA HBeAg Nồng độ HBV-DNA HBeAg (+) HBeAg (-) p N % n % < 0,05 <102 copies/mL 0 0 9 47,4 102-105 copies/mL 3 15,8 4 21,0 >105 copies/mL 16 84,2 6 31,6 Tổng 19 100 19 100
Nhận xét: Đa số nhóm HBeAg (+) có nồng độ HBV-DNA >105 copies/mL chiếm 84,2%, không gặp bệnh nhân nào có nồng độ HBV-DNA <102 copies/mL. Nhóm HBeAg (-): 47,4% có nồng độ HBV-DNA <102 copies/mL, 21,0% có nồng độ HBV-DNA từ 102-105 copies/mL và 31,6% có nồng độ HBV-DNA >105 copies/mL. Sự khác biệt về nồng độ HBV-DNA với 2 nhóm HBeAg (+) và HBeAg (-) có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu thu được ở 38 bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, chúng tôi có một số nhận xét và bàn luận như sau:
4.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới 4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Kết quả nghiên cứu về lứa tuổi và giới ở các bệnh nhân nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 60,5%, nữ chiếm 39,5%, như vậy số bệnh nhân nam mắc viêm gan virus B mạn tính chiếm tỷ lệ cao hơn số bệnh nhân nữ. Các nghiên cứu của nhiều tác giả trong