1.4.1. Phương pháp PCR
1.4.1.1 Khái niệm
PCR (Polymerase Chain Reaction): là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của hai mồi oligonucleotit gắn vào hai sợi khuôn của đoạn DNA khuôn với sự tham gia của DNA polymerase [8].
1.4.1.2. Nguyên lý chung của phương pháp PCR
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục gồm nhiều chu kì kế tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn [8]:
Giai đoạn biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ 940C (cao hơn Tm của DNA khuôn), làm đứt các liên kết của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau.
Giai đoạn gắn mồi (Annealing): ở nhiệt độ 55-650C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff.
Giai đoạn tổng hợp (Elongation): nhiệt độ 70-720C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzym DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotit vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì trước lại được làm khuôn ở chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kì, từ mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220-240 bản sao DNA. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kì sau lượng khuôn tăng lên, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu
dần…do đó cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt.
Hình 1.2: Hình minh họa kỹ thuật PCR
1.4.1.3 Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR
PCR là kĩ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm dựa vào chu kì nhiệt độ nhờ nguyên liệu: ống nghiệm chứa dung dịch phản ứng gọi là PCR mix thể tích khoảng 10-50µg có các thành phần chủ yếu [8]:
- Taq polymerase chịu nhiệt có hoạt tính tối ưu tại 720C và bền với nhiệt độ.
- 4 loại dNTP là adenine, thymin, guanin, cytosine (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
- DNA chứa các DNA đích sẽ được nhân bản trong phản ứng.
- Các loại mồi (primer xuôi và ngược là các đoạn olygonucleotit có chiều dài khoảng 20-30 nucleotit có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.
- Ion Mg++ trong muối MgCl ở nồng độ thích hợp làm dung môi cho phản ứng.
Khi PCR mix cho vào buồng ủ chu kì nhiệt của máy luân nhiệt tức là máy PCR và theo chu kì nhiệt phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra.
1.4.1.4 Phân tích sản phẩm PCR
Khi phản ứng kết thúc, chúng ta cần phân tích sản phẩm PCR tạo thành để có thể xác định mức độ thành công của phản ứng. Phương pháp thông thường nhất là xác định kích thước của đoạn DNA nhờ điện di trên gel agrose. Sự thành công hay thất bại của phản ứng có thể được xác định bằng các cách sau [8]:
- Có sản phẩm của phản ứng không.
- Kích thước của sản phẩm có đúng như dự kiến không. - Có sản phẩm phụ không.
Tùy thuộc vào mức độ thành công của phản ứng PCR đầu tiên mà chúng ta có thể thay đổi các điều kiện để tối ưu hóa quy trình phản ứng.
1.4.1.5 Ứng dụng của phản ứng PCR trong y học
Ngày nay, kĩ thuật PCR có thể phục vụ cho nhiều mục đích ứng dụng khác nhau. PCR đã tạo ra một cuộc cách mạng về các hướng tiếp cận từ lĩnh vực nghiên cứu khoa học cơ bản, y học cơ sở đến các xét nghiệm y học. Kỹ thuật này là một công cụ hữu hiệu cho các nhà nghiên cứu tại tất cả các phòng thí nghiệm hiện đang sử dụng kĩ thuật PCR hàng ngày. Kỹ thuật này giúp chúng ta đi từ những quy trình cơ bản nhất để đạt được những mục đích cao hơn [8].
PCR thực sự là công cụ hữu hiệu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện DNA, một dấu ấn cho biết sự có mặt của các tác nhân vi sinh vật dù ở mức độ rất nhỏ. Chính vì vậy, PCR được ứng dụng hiệu quả trong việc phát hiện các sinh vật biến đổi gen, phát hiện nhanh các mầm bệnh ở mức độ rất thấp và là một phương tiện hữu ích trong việc sàng lọc bộ gen để phát hiện sự có mặt của một gen đích bất kì nào đó.
BRCA 1-BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em…), nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
Trong vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp [8]:
- Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, HPV…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma…).
- Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M. tuberculosis. - Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng nào mủ mất đầu…). PCR cũng được dung để xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của E. coli, độc tố ruột của vi khuẩn tả…
PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn.
Trong lĩnh vực ký sinh trùng, người ta dùng kĩ thuật PCR trong chẩn đoán lỵ amip, Leishmania, Echinococcus, Giardia, Toxoplasma…
Ứng dụng sinh học phân tử bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và nhiều cải tiến quan trọng góp phần đo được nồng độ HBV trong huyết tương nên tiên lượng bệnh mạn tính chính xác hơn, biết nguyên nhân kháng thuốc và mở rộng ra biết đột biến của gonotype, sáng tỏ viêm gan mạn tính tiềm ẩn và viêm gan mạn tính HBeAg (-), đánh giá kết quả điều trị với thuốc ức chế HBV [12].
1.4.1.6 Ưu, nhược điểm của phản ứng PCR
- Ưu điểm:
+ Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm.
+ Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
- Nhược điểm:
+ Cẩn phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotit cần khuếch đại.
+ Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb.
+ Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng 104 (sai sót cho 1 lần sao chép).
1.4.2. Phương pháp Realtime PCR
1.4.2.1 Nguyên lý chung
Phương pháp Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong Realtime PCR người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi để phát huỳnh quang và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang. Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ đặc biệt được gắn với một module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
1.4.2.2 Các thành phần trong phản ứng realtime PCR
Cũng giống như phản ứng PCR thành phần của phản ứng Realtime PCR cũng bao gồm như sau: Dung dịch đệm (Buffer), dNTPs, Taq DNA Polymerase, mồi (primer), Mg2+…và chất phát huỳnh quang.
Trong phản ứng Realtime PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide,
SYBR Green, EvaGreen…) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX…).
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện
diện của DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn. Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp, nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy.
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của tác nhân liên kết với mạch đôi DNA Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu: Rất đa dạng như FAM,
TARMA, Texas Red, Cy3, Cy5…được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như Taqman probe, Beacon probe, probe lai.
Probe được dịch là đoạn dò hay dò, đó là những đoạn oligonucleotit sợi đơn có một trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên đoạn DNA khuôn. Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt gặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại và khi có sự
bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime sử dụng Taqman probe.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn, do vậy mà huỳnh quang phát ra từ repoter từ đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì taqman probe sẽ bắt cặp với sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Enzym taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp thành sợi bổ sung, do vậy repoter của probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang
lượng repoter tự do ngày càng nhiều và đến một lúc cường độ huỳnh quang phát ra từ repoter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime PCR sử dụng beacon probe
Beacon probe là probe có trình tự dài khoảng 25-40 base, có đầu 5’ gắn với repoter và đầu 3’ gắn với quencher. Beacon probe có trình tự ở giữa dài khoảng 15-39 base bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên sợi DNA khuôn, còn hai đầu của probe có trình tự khoảng 5-6 base bổ sung với nhau làm cho probe có cấu trúc hình kẹp tóc.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của Beacon probe
Ở giai đoạn nhiệt độ biến tính, cấu trúc kẹp tóc của beacon probe không còn, nên nếu ở giai đoạn này repoter nhận được nguồn sáng kích thích thì nó sẽ phát huỳnh quang.
Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì cấu trúc kẹp tóc của hai đầu probe đã làm cho repoter gần với quencher nên tất cả huỳnh quang phát ra từ repoter đều bị quencher hấp phụ. Nhưng khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, beacon probe sẽ bắt
cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi DNA đích của sản phẩm khuếch đại làm cho repoter cách xa quencher nên repoter phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Trong giai đoạn nhiệt độ kéo dài, enzym taq DNA polymerase không thủy giải beacon probe mà chỉ tách probe ra khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, beacon probe tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho repoter phát tín hiệu huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime PCR sử dụng probe lai
Trong kỹ thuật này, người ta sử dụng hai probe lai: Probe lai 1 có đầu 3’ có gắn một chất phát huỳnh quang D (Donor) và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một chất phát huỳnh quang A (Accepter). Để tránh không cho probe lai 2 này có thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 2 gắp thêm một gốc phosphat.
Nguyên lý như sau:
Hình 1.6. Cơ chế hoạy động của Probe lai
Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì D của probe lai 1 phát huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích thích nhưng thiết bị realtime không ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang này vì ánh sáng phát ra từ D không qua được kính lọc để đến CCD camera hay cảm quang. Nếu có sản phẩm khuếch đại hiện diện thì probe lai 1 và probe lai 2 gắn
cho A phát huỳnh quang và thiết bị realtime sẽ ghi nhận được huỳnh quang này nếu lượng sản phẩm khuếch đại đạt đủ ngưỡng để huỳnh quang phát ra từ A qua được kính lọc đến CCD camera hay cảm quang của thiết bị realtime.
1.4.2.3 Ứng dụng của Realtime PCR [24]
- Định lượng tuyệt đối:
Ví dụ: Copies/mL của HBV, HCV, HIV trong máu so với mẫu chuẩn. - Định lượng tương đối:
+ Xác định biến đổi gen của sản phẩm nông nghiệp thủy sản. + Định lượng biểu hiện gen P53 cản trở ung thư…
- Xác định genotype, đột biến kháng thuốc HBV, HCV, đột biến precore, core promotor HBV, định danh nấm, vi khuẩn và kháng thuốc.
CHƯƠNG 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn tính và điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
2.1.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: tháng 7/2014 đến 5/2015
- Địa điểm: bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Theo quyết định số 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 của Bộ trưởng Bộ Y tế về chẩn đoán xác định viêm gan virus B mạn tính như sau:
- HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc-IgG (+). - AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng.
- Có bằng chứng tổn thương mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xác định bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan hoặc Fibrotest hoặc chỉ số APRI) mà không do căn nguyên khác.
2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ
Loại trừ các bệnh nhân có đặc điểm sau: - Bệnh nhân < 15 tuổi.
- Có anti HAV-IgM dương tính, anti HCV dương tính hoặc đồng nhiễm HIV.
- Viêm gan do rượu, viêm gan do thuốc. - Đã có dấu hiệu xơ gan hoặc ung thư gan. - Phụ nữ có thai.
- Bệnh nhân đang mắc bệnh kết hợp như: sốt rét, tiểu đường, viêm đường mật, tăng huyết áp…
- Bệnh nhân bị bệnh về máu.
- Bênh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp với nghiên cứu hồi cứu.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu và cách chọn mẫu
- Cỡ mẫu: Toàn bộ bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn tính điều trị tại bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương (N=38).
- Cách chọn mẫu:
+ Liên hệ thực tế và tiến hành nghiên cứu ngang bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B.
+ Lập danh sách toàn bộ bệnh nhân nhiễm viêm gan virus B bao gồm thông tin về: họ tên, tuổi, giới, địa chỉ liên hệ.
2.2.3. Kỹ thuật thu thập số liệu
2.2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
Các đối tượng nghiên cứu được thu thập số liệu nghiên cứu theo mẫu