Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.5. Phương phỏp nghiờn cứu sử dụng nấm ký sinh cụn trựng phũng trừ sõu mọt 1 Phương phỏp tạo chế phẩm nấm để phũng trừ sõu mọt
2.5.1. Phương phỏp tạo chế phẩm nấm để phũng trừ sõu mọt
Cỏc mẫu nấm ký sinh cụn trựng thuộc ba loài Beauveria amorpha, Beauveria
bassiana và Paecilomyces sp1. được thu thập từ VQG Pự Mỏt và trại nụng nghiệp
Tiến hành 4 đợt thu thập EPF ở những khu rừng nguyờn sinh, những nơi bằng phẳng hoặc cú độ dốc khụng quỏ lớn, nơi cú nhiều cõy lớn và đất tơi xốp. Trong mựa khụ cú thể thu thập EPF dọc cỏc khe suối của khu rừng. EPF được thu trờn lỏ (mặt dưới của cỏc lỏ già), thõn cõy và trờn cỏc tàn dư thực vật. EPF cũng thu được ở hệ sinh thỏi nụng nghiệp.
Phõn lập, nhõn giống và tạo sinh khối nấm
Phõn lập ba loài nấm ký sinh cụn trựng theo phương phỏp phõn lập bào tử đơn của Rossman (1996) [82]. Phõn lập ba loài nấm ký sinh cụn trựng: Beauveria amorpha,Beauveria bassiana và Paecilomyces sp1. sử dụng trong phũng trừ sõu mọt trờn mụi trường PDA hoặc SDA cú bổ sung khỏng sinh penicillin 0,25g/l.
Đối với cỏc mẫu EPF thuộc nhúm Beauveria, việc phõn lập được tiến hành bằng cỏch dựng que nuụi cấy lẫy một mẫu nhỏ mụi trường cú kớch thước khoảng 0,05 mm2. Sau đú chuyển sang chấm nhẹ vào trờn mẫu vật để một số bào tử cú thể dớnh vào
mụi trường đú. Cấy chuyển sang mụi trường PDA hoặc SDA. Cũng cú thể dựng que nuụi cấy lấy trực tiếp bào tử trờn mẫu vật rồi cấy lờn mụi trường PDA hoặc SDA.
Đối với cỏc mẫu EPF thuộc nhúm Paecilomyces, phõn lập bằng cỏch quột trực tiếp cấu trỳc sinh bào tử lờn bề mặt của mụi trường PDA hoặc SDA, với điều kiện phải ỳp mặt của đĩa mụi trường xuống phớa dưới để hạn chế nhiễm khuẩn hoặc cỏc loại nấm khỏc.
Sau đú, cỏc đĩa phõn lập được đặt vào trong hộp nhựa ẩm và bảo quản ở nhiệt độ 250C. Việc phõn lập được tiến hành quan sỏt 1 lần/ngày dưới kớnh hiển vi soi nổi, nhằm quan sỏt quỏ trỡnh nảy mầm của bào tử và loại bỏ những loài nấm khỏc ra khỏi mụi trường. Sau khi bào tử đó nảy mầm, tiến hành sử dụng que nuụi cấy đó tiệt trựng để cấy chuyển sang đĩa mụi trường mới và đặt trong hộp nhựa ẩm ở điều kiện tương tự trong 4 tuần để cho nấm sinh trưởng và phỏt triển.
Hỡnh 2.1. Quy trỡnh nhõn sinh khối nấm ký sinh cụn trựng
Sản xuất chế phẩm nấm bột theo phương phỏp lờn men xốp của Lomer (1998) [75] bằng cỏc nguyờn liệu dễ kiếm trong nước như: Cỏm gạo, bột ngụ, bột mỡ, trấu, ... theo quy trỡnh được nờu ở hỡnh 2.1.
- Mẫu nấm phõn lập - Mẫu nấm bảo quản Nhõn giống cấp I trờn
mụi trường PDA Nhõn giống cấp II Nhõn giống cấp III Thử nghiệm khả năng
Tạo chế phẩm nấm dạng dung dịch: Nấm sinh trưởng, phỏt triển trờn mụi trường PDA sau khi phõn lập khoảng 30 - 40 ngày thỡ cú thể sử dụng để tạo dịch bào tử nấm cho phũng trừ.
Xỏc định lượng sinh khối của chế phẩm nấm (nồng độ bào tử nấm) bằng buồng đếm hồng cầu.
2.5.2. Phương phỏp sử dụng chế phẩmnấm phũng trừ sõu mọt
Phương phỏp thử nghiệm khả năng phũng trừ sõu mọt hại kho của ba chế phẩm nấm Beauveria amorpha, Beauveria bassiana và Paecilomyces sp1. được tiến hành theo Govindan Sheeba và cs. (2001) [63, tr. 117-120], Hendrawan Samodra và Yusof Ibrahim (2006) [65, tr. 1-7], Lomer (1998) [75].
- Thớ nghiệm 1: Đỏnh giỏ hiệu quả phũng trừ 4 loài mọt là mọt gạo S. oryzae, mọt ngụ S. zeamais, mọt thúc đỏ T. castaneum và mọt khuẩn đen A. diaperinus
bằng chế phẩm dạng dung dịch được tạo ra từ 2 loài nấm ký sinh cụn trựng B. amorpha và B. bassiana ở 2 nồng độ bào tử khỏc nhau là 2,5 x 106 và 3,8 x 107
bào tử/ml. Thớ nghiệm 2 nhõn tố (chế phẩm nấm và nồng độ bào tử), được bố trớ theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiờn (RCBD) với hai chế phẩm được tạo ra từ 2 loài EPF ở hai mức nồng độ khỏc nhau. Thớ nghiệm được bố trớ với 4 cụng thức như sau:
Cụng thức 1: Xử lý với CPNN B. amorpha 2,5 x 106 bt/ml. Cụng thức 2: Xử lý với CPNN B. amorpha 3,8 x 107 bt/ml. Cụng thức 3: Xử lý với CPNN B. bassiana 2,5 x 106 bt/ml. Cụng thức 4: Xử lý với CPNN B. bassiana 3,8 x 107 bt/ml.
- Thớ nghiệm 2: Đỏnh giỏ hiệu quả phũng trừ 4 loài mọt là mọt gạo S. oryzae, mọt ngụ S. zeamais, mọt thúc đỏ T. castaneum và mọt khuẩn đen A. diaperinus của 3 chế phẩm nấm bột B. amorpha, B. bassiana và Paecilomyces sp1. ở 2 mức liều lượng khỏc nhau (2,0g và 3,0g). Thớ nghiệm 2 nhõn tố (chế phẩm nấm và liều lượng chế phẩm), được bố trớ theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiờn (RCBD) với ba chế phẩm được tạo ra từ
3 loài EPF ở hai mức liều lượng khỏc nhau. Thớ nghiệm được bố trớ với 6 cụng thức như sau: Cụng thức 1: Xử lý với CPNB B. bassiana 1,2 x 108 bt/g (2,0g).
Cụng thức 2: Xử lý với CPNB B. bassiana 1,2 x 108 bt/g (3,0g). Cụng thức 3: Xử lý với CPNB B. amorpha 1,2 x 108 bt/g (2,0g). Cụng thức 4: Xử lý với CPNB B. amorpha 1,2 x 108 bt/g (3,0g).
Cụng thức 5: Xử lý với CPNB Paecilomyces sp1. 8,6 x 108 bt/g (2,0g). Cụng thức 6: Xử lý với CPNB Paecilomyces sp1. 8,6 x 108 bt/g (3,0g). Cụng thức đối chứng cho cả 2 thớ nghiệm trờn khụng xử lý chế phẩm nấm. Mỗi cụng thức gồm 50 con mọt trưởng thành/100g thức ăn tương ứng với mỗi loài mọt, nhắc lại 3 lần. Thớ nghiệm được bố trớ ở điều kiện nhiệt độ 28 ± 20C, độ ẩm 60 - 95%. Bào tử nấm theo cỏc nồng độ, liều lượng tương ứng được trộn đều với thức ăn đó được xử lý với 0,1% Tween 80, lắc đều trong 10 phỳt bằng mỏy lắc.
Tỷ lệ chết của mọt được ghi lại theo định kỳ 5 ngày/1lần trong thời gian 30 ngày và tất cả cỏc con mọt chết được chuyển đi sau mỗi lần đếm.
Hiệu lực diệt sõu mọt của cỏc chế phẩm nấm được tớnh theo cụng thức Abbott (1925) [46]. Tỷ lệ sõu mọt chết (± SD) được phõn tớch ANOVA.