2. THỰC NGHIỆM
2.3.3.2.Biến nạp vector biểu hiện pPICZαA/phyAs/PmeI vào P pastoris
Hai chủng nấm men P. pastoris X33 (Mut+) và P. pastoris KM71H (MutS) được chọn làm tế bào biểu hiện. Kỹ thuật biến nạp bằng xung điện được lựa chọn do ưu thế về
hiệu suất biến nạp. Các tế bào nấm men P. pastoris đang phát triển ở giai đoạn giữa pha log được thu lại và được rửa với nước cất khử ion vô trùng để loại bỏ hết tạp chất và ion tồn tại hỗn hợp tế bào. Dưới tác dụng của điện trường cực lớn làm thủng màng tế bào và các phân tử ADN plasmid pPICZαA di chuyển theo điện trường vào trong tế bào. Theo dự tính, pPICZαA được mở vòng sẽ trao đổi chéo và tích hợp vào vùng gene AOX1 của
P. pastoris do chúng có chung đoạn gene này.
Các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường YPDS có bổ sung 100 mg/l zeocin. Tế bào nấm men bình thường không có khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa zeocin. Tuy nhiên plasmid tái tổ hợp pPICZαA/phAs có chứa gene kháng zeocin, nên chỉ
những tế bào P. pastoris chứa plasmid pPICZαA mới có khả năng sinh trưởng trên môi trường có zeocin.
Sau 3 ngày nuôi cấy đã xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chứng tỏ chủng nấm men tái tổ
hợp có khả năng kháng zeocin và plasmid pPICZαA đã được tích hợp vào genome của nấm men (hình 18, 19).
(a) Biến nạp bằng pPICZαA/phyAs/PmeI (b) Đối chứng (biến nạp bằng nước cất)
Hình 18. Các tế bào P. pastoris KM71H sau biến nạp với plasmid biểu hiện pPICZαA/phyAs/PmeI mọc trên đĩa môi trường YPDS chứa 100 mg/l zeocin (a) và đĩa đối chứng chứa tế bào P. pastoris KM71H không biến nạp (b).
(a) Biến nạp bằng pPICZαA/phyAs/PmeI (b) Đối chứng (biến nạp bằng nước cất)
Hình 19. Các tế bào P. pastoris X-33 sau biến nạp với plasmid biểu hiện pPICZαA/phyAs/Pme I mọc trên đĩa môi trường YPDS chứa 100 mg/l zeocin (bên trái) và đĩa đối chứng chứa tế bào P. pastoris X-33 không biến nạp (bên phải).
Với mục đích kiểm tra tế bào nấm men đã mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số dòng tế bào mọc trên môi trường chứa zeocin để tách chiết ADN tổng số, dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi chéo α-factor
Hình 20. Kiểm tra sự có mặt phyAs trong P. pastoris bằng cặp mồi chéo. M: Thang ADN chuẩn; C: Đối chứng dương; 1-4: sản phẩm của chủng X33; 5-8: Sản
phẩm của chủng KM71H
Chúng tôi tách AND của 8 khuẩn lạc trong đó 1- 4 là số thứ tự khuẩn lạc của P. pastoris X33 và 5-8 là số số thứ tự khuẩn lạc của P. pastoris KM71H. Kết quả cho thấy khi sử dụng cặp mồi chéo sản phẩm PCR cho 1 band duy nhất khoảng 1,4 kb duy có một khuẩn lạc số 1 của X33 không hiện band có thể là do lượng AND khuôn tách chiết chưa tốt hoặc quá ít. Như vậy với kết quả trên có thể khẳng định vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs đã được gắn vào genome của nấm men P. pastoris.