Các phương pháp tạo enzyme không tan

Có thể sư dụng các phương pháp như hấp phụ vật lý, nhôt enzyme trong gel, tạo liên kết chéo giữa các phân tư enzyme hoặc gắn enzyme vào chất mang bằng liên

kết cộng hóa trị. Điều quan trọng là lựa chọn phương pháp sao cho enzyme không tan có độ bền và ít mất hoạt tính.

Phương pháp hấp phụ vật lý.

Trong phương pháp này enzyme không tạo liên kết cộng hóa trị với chất mang, enzyme được hấp phụ vật lý trên bề mặt chất mang. Đây là phương pháp được sư dụng đầu tiên trong cô định enzyme. Năm 1916, người ta cho invertase hấp phụ trên than tạo ra enzyme không tan có khả năng thủy phân đường saccharose. Phương pháp này dễ thực hiện và ít ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên enzyme dễ bị rưa trôi trong những lần tái sư dụng. Mức độ giữ enzyme trên chất mang phụ thuộc vào pH, lực ion, nồng độ enzyme..

Chất mang được sư dụng ở đây là những chất không tan trong nước, có cấu trúc lỗ xôp, có diện tích tiếp xúc lớn. Có thể sư dụng cả chất mang hữu cơ lẩn vô cơ như các loại sau: Cellulose và các dẫn xuất của nó như DEAE-cellulose, CM- cellulose; dextran và các dẫn xuất của dextran; hydroxyl apatite, calcium phosphate.

Trong thực tế để hạ giá thành sản phẩm người ta có thể chọn những chất mang rẻ tiền như đất sét, than, mạt cưa hoặc bột giấy.

Phương pháp này có nhược điểm dễ xảy ra hiện tượng phản hấp phụ làm giảm hoạt tính enzyme, do đó khả năng tái sư dụng không cao, vì vây để cải tiến người ta dùng phương pháp khác hoặc kết hợp các phương pháp với nhau

Phương pháp nhốt enzyme trong chất mang.

Với phương pháp này enzyme được giữ bên trong chất mang, chất mang có cấu trúc lưới hoặc lỗ không cho enzyme đi qua nhưng cho cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hóa và sản phẩm phản ứng đi qua. Có ba cách tạo enzyme không tan theo phương pháp này.

- Cách nhôt enzyme trong gel: enzyme được trộn cùng với dung dịch monomer nào đó. Sau đó tiến hành trùng hợp nhờ các tác nhân khâu mạch như hóa chất, tia tư ngoại, ánh sáng..các polymer hình thành chứa enzyme bên trong. Các chất tạo gel thường được sư dụng như alginate, carrageenan, polyacrylamide. Dung dịch muôi natri của alginate hòa cùng dung dịch enzyme, sau đó thêm từng giọt dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành gel calcium alginate có chứa enzyme bên trong. Phương pháp này được dùng khá rộng rãi vì thực hiện đơn giản và alginate dễ tìm.

Nguyên liệu thứ hai được dùng nhiều là acrylamide: cho dung dịch acrylamide trộn lẫn với enzyme, dùng N,N’-methylen bisacrylamide làm tác nhân khâu mạch, gel polyacrylamide hình thành có enzyme bên trong

Hình 5.1 Enzyme được giữ trong gel polyacrylamide

- Cách hai:đưa enzyme vào các sợi bằng cách cho hỗn hợp có chứa các thành phần để trùng hợp và enzyme đi qua mắt lưới, hoặc có thể cho dung dịch enzyme đi qua sợi rỗng, sợi có lỗ tạo điều kiện để enzyme gắn vào.

- Cách ba:tạo bao vi nang (micro capsule) enzyme được bọc trong màng bán thấm.Phương pháp này hầu như không ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tư enzyme và có thể đồng thời bọc nhiều enzyme xúc tác cho một chuỗi phản ứng trong cùng một túi. Người ta cũng có thể tạo ra chế phẩm enzyme không tan ở dạng liposome.

Phương pháp nhôt có ưu điểm không làm ảnh hưởng đến trung tâm hoạt tính của enzyme nhưng có khuyết điểm là chất mang thường không cho các cơ chất phân tư lớn đi qua, do đó các enzyme protease hoặc nuclease không dùng phương pháp này.

Phương pháp tạo liên kết chéo

Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang mà thường dùng các tác nhân lưỡng chức có hai nhóm hoạt động, các nhóm hoạt động liên kết với các các phân tư enzyme tạo liên kết chéo giữa chúng, khâu các phân tư enzyme lại với nhau tạo thành các phân tư có kích thước lớn, không tan có thể tách khỏi dung dịch bằng lọc hoặc ly tâm. Các tác nhân khâu mạch thường dùng như;

Phương pháp tạo liên kết chéo có ưu điểm là có thể liên kết nhiều enzyme lại với nhau, nhưng nhược điểm là thường ảnh hưởng đến trung tâm hoạt tính của enzyme.

Phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị .

Phương pháp này đòi hỏi chất mang phải có các đặc tính sau: Bề mặt chất mang phải tương thích với enzyme, phải có các nhóm có khả năng phản ứng với các nhóm chức của enzyme nhưng không ảnh hưởng đến trung tâm hoạt tính, chất mang phải có tính trơ với thành phần phản ứng và bền trong điều kiện phản ứng kéo dài. Chất mang được sư dụng ở đây có thể là chất mang vô cơ, polymer tự nhiên hoặc polymer tổng hợp.Để gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, chất mang phải được hoạt hóa trước sau đó mới gắn vào enzyme. Tùy thuộc bản chất của chất mang, có các phương pháp hoạt hóa sau đây:

- Hoạt hóa bằng cyanogen bromide ( BrCN ) được sư dụng phổ biến để hoạt hóa chất mang có các nhóm OH như cellulose, dextran…Phản ứng hoạt hóa xảy ra trong môi trường kiềm. Chất mang đã hoạt hóa có khả năng liên kết với nhóm NH2 của phân tư enzyme

Chất hoạt hóa BrCN và các sản phẩm trung gian tạo thành rất độc, do đó cần có thiết bị bảo vệ trong khi tiến hành nghiên cứu sản xuất.

- Hoạt hóa bằng glutaraldehyde: Các chất mang có chứa nhóm NH2 như polyacrylamide, chitosan, chitin…đều có thể sư dụng phương pháp này. Glutaraldehyde là một chất có hai nhóm aldehyde, một nhóm sẽ kiên kết với NH2 của chất mang và nhóm còn lại sẽ liên kết với NH2 của enzyme

Hoạt hóa bằng phosgel: nếu chất mang có gôc NH2 có thể hoạt hóa bằng phosgel hoặc thiophosgel để tạo thành dẫn xuất isocyanate hoặc isothiocyanate. Các nhóm này ở pH trung tính dể dàng kết hợp với nhóm NH2 của enzyme

- Hoạt hóa bằng phản ứng diazo: Những chất mang có nhóm NH2 có thể sư dụng phương pháp này. Muôi diazo của chất mang hoạt hóa không những chỉ phản ứng với nhóm NH2 mà cả với nhóm phenol, imidazol của enzyme. Phản ứng cộng hóa trị xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thường và môi trường trung tính

- Hoạt hóa bằng muôi azide: Phương pháp này được dùng để hoạt hóa chất mang có mang nhóm –COOH như CM-cellulose, gelatin…Nhóm COOH được ester hóa trước, sau đó cho phản ứng với hydrazine tạo hydrazide, hydrazide phản ứng với NaNO2 trong HCl tạo muôi azide, muôi này dể dàng tạo liên kết cộng hóa trị với nhóm NH2 của enzyme

- Hoạt hóa bằng carbodiimide: Dùng cho chất mang có nhóm –COOH, thực hiện trong môi trường acid. Carbodiimide làm chất ngưng tụ hình thành liên kết peptide giữa nhóm COOH của chất mang với nhóm NH2 của enzyme

Phương pháp tạo liên kết công hóa trị tạo ra enzyme không tan có độ bền cao, có thể sư dụng trong nhiều quá trình sản xuất ở qui mô lớn. Do enzyme gắn trên bề mặt của chất mang nên dể tiếp xúc với cơ chất. Tuy nhiên cũng có một sô hạn chế, cấu trúc

của enzyme có thể bị thay đổi một phần trong quá trình gắn với chất mang, do liên kết chặt giữa enzyme và chất mang làm giảm khả năng di chuyển tự do của enzyme.

Để tạo enzyme không tan có thể sư dụng nhiều chất mang khác nhau, nhiều phương pháp khác nhau tùy thuộc vào điều kiện cho phép miễn sao enzyme tạo được tôt nhất.

Các hương liệu tổng hợp

Tổng hợp kháng sinh β-lactam