Tổng hợp aminoacid

Trong sô 20 aminoacid tham gia trong thành phần của protein, có 8 aminoacid

mà con người và động vật không tổng hợp được, chúng được gọi là các aminoacid không thay thế. Thiếu các aminoacid nói trên trong khẩu phần thức ăn sẽ dẫn đến rôi loạn trao đổi chất trong cơ thể, làm chậm sự sinh trưởng và phát triển.Trong công nghiệp các aminoacid được sản xuất theo ba phương pháp: - Hóa giải: thủy phân các nguồn protein tự nhiên bằng kiềm hoặc acid, thu hỗn

hợp aminoacid rồi dùng biện pháp tách riêng từng aminoacid một, phương pháp này khá tôn kém và một sô aminoacid bị phá hỏng bởi acid hoặc kiềm. - Dùng phương pháp tổng hợp hóa học sản phẩm thu được ở dạng racemic bao

gồm hai dạng đồng phân D và L- aminoacid, do đó phải tách riêng hai dạng này ra nên khá tôn kém.

- Tổng hợp từ vi sinh vật bằng con đường lên men, đây là phương pháp có nhiều ưu điểm do vi sinh vật có khả năng tổng hợp aminoacid cao, môi trường lêm men rẻ tiền, vì vậy hiệu quả kinh tế cao. Phần lớn sản lượng aminoacid hiện nay trên thế giới được sản xuất theo con đường này.

Ngoài các aminoacid không thay thế như lysine, methionine,…được tổng hợp để bổ sung vào thực phẩm hoặc dùng ở dạng thuôc thì có những aminoacid được tổng hợp nhiều với mục đích sản xuất gia vị như acid glutamic.Ngày nay hàng năm trên thế giới đã sản xuất trên 500000 tấn aminoacid, Nhật bản là nước dẫn đầu trong lãnh vực này với acid glutamic chiếm tới 64% tổng sản lượng của thế giới , sau acid glutamic thì lysine và methionine cũng được sản xuất nhiều.

Tổng hợp acid glutamic: tuy không phải là aminoacid không thay thế nhưng acid glutamic được tổng hợp nhiều với mục đích làm nguyên liệu để tạo bột ngọt. Trước đây acid glutamic chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp hóa giải từ bột mì, từ 1957 trở đi hầu hết acid glutamic được sản xuất nhờ phương pháp lên men từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Nhật bản là nước có sản lượng acid glutamic chiếm 50% sản lượng acid glutamic của thế giới

Chủng vi khuẩn sản xuất thừa acid glutamic: Corynebacterium glutamicum được phân lập vào năm 1957 bởi Kinoshita là vi khuẩn gram dương không tạo bào tư không di động cần biotin cho sinh trưởng, tuy nhiên chủng dùng cho sản xuất có khả năng tổng hợp thừa acid glutamic nhờ những đột biến về kiểu gen, với các chủng sản xuất trong điều kiện tôi ưu có thể tổng hợp 50g acid glutamic trên một lít canh trường.

Hình trên biểu diễn con đường tổng hợp thừa acid glutamic ở vi khuẩn

Corynebacterium glutamicum do sự kết hợp của các yếu tô sau đây:

- Trong các chủng sản xuất, không có mặt enzyme α-ketoglutarate dehydrogenase(3), do đó α-ketoglutarate không tạo ra succinate.

- Enzyme isocitrate dehydrogenase(1) và L-glutamate dehydrogenase(2) hoạt động rất mạnh để hình thành acid glutamic, có bao nhiêu α-ketoglutarate được tạo thành đều amin hóa trực tiếp thành acid glutamic.

- Các phản ứng bù đắp tái tạo malate và oxaloacetate theo các con đường nhờ enzyme pyruvate carboxylase(4) tạo oxaloacetate, phosphoenolpyruvate carboxylase (5) tạo malate và từ chu trình glyoxylate(6) tạo malate.

- Tính thấm của màng tế bào bị thay đổi do thiếu biotin hoặc tác dụng của penicillin nên acid glutamịc từ nội bào được chuyển ra ngoài làm nồng độ acid glutamic nội bào thấp do đó không gây ức chế tổng hợp acid glutamic. Môi trường lên men: nguồn carbon thường dùng là glucose hoặc saccharose từ rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột, dịch thủy phân cellulose, nồng độ đường trong môi trường từ 8-25%. Ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới hiện nay thường sư dụng nguồn carbon từ dịch thủy phân tinh bột sắn và rỉ đường.

Ngoài carbon trong môi trường còn sư dụng urea để cung cấp ni tơ với tỉ lệ 1,5- 2%, Urea không những là thành phần dinh dưỡng cho vi khuẩn mà còn là nguyên liệu để tổng hợp acid glutamic, cũng có thể sư dụng các muôi amoni thay cho urea trong môi trường lên men. Các muôi khoáng như KH2PO4, MgSO4, MnSO4….Là thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của vi sinh vật.

Sau khi chuẩn bị môi trường được điều chỉnh pH= 6,8- 7,8 khư trùng và cấy giông vào. Lên men acid glutamic theo kiểu từng mẻ hiệu quả hơn là lên men liên tục, tiến hành lên men ở nhiệt độ 30oC từ 2-3 ngày, thông khí liên tục.

Tách, làm sạch và kết tinh acid glutamic: acid glutamic trong dịch nuôi cấy sau khi kết thúc quá trình lên men cần được tách và kết tinh, có nhiều phương pháp tách acid glutamic khác nhau, tuy nhiên hai phương pháp hiệu quả nhất là phương pháp điểm đẳng điện và phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Phương pháp điểm đẳng điện đơn giản nên được sư dụng ở nhiều nhà máy, từ dịch lên men người ta cô đặc để giảm lượng nước, sau đó dùng HCl đưa pH đến điểm đẳng điện của acid glutamic là 3,2, tại điểm đẳng điện acid glutamic kết tủa, ly tâm và tách riêng acid glutamic ra có thể hòa tan acid glutamic trở lại và kết tinh lần hai, nhược điểm của phương pháp là hiệu suất thu hồi chỉ đạt từ 50-60% acid glutamic có trong dịch lên men.

Phương pháp sắc ký trao đổi ion: cho dịch sau lên men chảy qua cột sắc ký có các hạt nhựa trao đổi, có hai loại nhựa trao đổi là rezin dương tính ký hiệu chung là RH có tính acid như RSO3H , RCOOH và dạng thứ hai là rezin âm tính ký hiệu chung ROH có tính kiềm như RNOH, RNH3OH. Sau khi dịch lên men chảy qua cột acid glutamic được giữ lại trên các hạt nhựa, sau đó dùng phản hấp phụ để đẩy acid glutamic ra khỏi nhựa. Phương pháp này có ưu điểm hiệu suất thu hồi acid glutamic cao.

Muôn sản suất bột ngọt, người ta cho NaOH phản ứng với dịch acid glutamic để tạo ra muôi glutamate natri ( bột ngọt), dịch glutamate natri thu được đem cô đặc rồi kết tinh thu được bột ngọt có dạng tinh thể hình kim, nếu tiến hành kết tinh hai lần cho sản phẩm có độ tinh khiết là 98% glutamate natri

Tổng hợp L-lysine: lysine là một aminoacid không thay thế người và động vật không tổng hợp được, vì vậy nó có ý nghĩa lớn trong dinh dưỡng . aminoacid này được chú trọng nghiên cứu và đưa vào sản xuất công nghiệp từ năm 1950, sản lượng ngày một tăng nhằm đáp ứng cho nhu cầu dinh dưỡng ở người và động vật Chủng vi khuẩn sản suất thừa lysine; Các chủng vi sinh vật tổng hợp lysine được dùng trong sản xuất là các thể đột biến thuộc giông vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum và Brevibacterium flavum, đây là các chủng có khả năng tổng hợp

thừa lysine do có đột biến liên quan đến điều hòa trao đổi chất. Dưới điều kiện thích hợp, các chủng này có thể sản xuất đến 50g lysine trên 1lít môi trường, nguyên liệu thường dùng là dịch rỉ đường hoặc glucose

Lysine là một aminoacid thuộc họ aspartate và được tổng hợp chung với methionine, threonine, isoleucine. Con đường sinh tổng hợp các aminoacid này được điều hòa theo cơ chế liên hệ ngược, enzyme asparto kinase(1) chịu sự điều hòa theo kiểu ức chế đa trị có nghĩa là nó chỉ bị ức chế khi trong môi trường có mặt đồng thời cả hai aminoacid như lysine và threonine, một aminoacid riêng lẻ không có tác dụng ức chế vì vậy khi trong môi trường không có threonine lysine sẽ được tổng hợp thừa mà asparto kinase vẫn không bị ức chế.

Ở các chủng sản xuất, enzyme homoserine dehydrogenase(2) bị khuyết do đó threonine, methionine và isoleucine không được hình thành vì vậy sự ức chế asparto kinase(1) bị triệt tiêu dẫn đến sản xuất thừa lysine.

Một điều kiện nữa dẫn đến sự tổng hợp thừa lysine đó là dihydropicolinate synthetase(3) không mẫn cảm với sản phẩm cuôi cùng là lysine, do đó không bị ức chế khi trong môi trường có nhiều lysine.

Môi trường lên men: nguồn cung cấp carbon là đường glucose từ dịch rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột….nồng độ đường trong môi trường len men khoảng từ 10- 12%, trong quá trình lên men có thể bổ sung thêm để nâng nồng độ đường tới 25%.Nguồn ni tơ thường dùng là urea , muôi amoni hoặc sư dụng cao ngô, bên cạnh đó cần bổ sung các muôi khoáng. Nhìn chung môi trường lên men lysine giông với môi trường tổng hợp aid glutamic, tuy nhiên có hai điểm khác biệt cơ

bản đó là trong lên men lysine cần nồng độ biotin cao và cần bổ sung homoserine( methionine+ threonine) vì các chủng sản xuất lysine đều không tổng hợp được hai aminoacid này nên cần bổ sung từ ngoài vào vừa đủ cho dinh đưỡng của vi khuẩn mà không làm ức chế asparto kinase. Sau khi pha xong cần điều chỉnh pH=7-7,6 khư trùng và chuẩn bị cấy giông vào, nhiệt độ thích hợp cho lêm men là 28-30oC đây là quá trình lên men hiếu khí nên cần khuấy sục khí trong suôt quá trình lên men, trong 12-18 giờ đầu chủ yếu là sự hình thành sinh khôi vi khuẩn giai đoạn sau mới bắt đầu tổng hợp lysine cho đến 72 giờ quá trình lên men kết thúc, trong điều kiện tôi ưu hiệu suất tổng hợp lysine có thể đạt 50g / lít.

Tách và hoàn thiện chế phẩm lysine: trong dịch lên men có chứa lysine, sinh khôi vi khuẩn và các thành phần nguyên liệu có trong môi trường cùng các sản phẩm phụ, vì vậy đây chỉ là dạng lysine thô có thể dùng trực tiếp pha vào thức ăn chăn nuôi.

Dịch lysine thô nói trên nếu để tự nhiên thì dễ bị hỏng, vì vậy phải acid hóa bằng HCl tới pH=5 và bổ sung 25% natri metabisulfite sau đó đem cô chân không đến khi độ ẩm còn 60%, trộn với chất độn như cám mì rồi sấy khô, dạng này được gọi là chế phẩm thô rắn có thể bảo quản trong nhiều tháng dùng cho chăn nuôi.

Từ dịch lên men có thể thu nhận lysine ở dạng kết tinh bằng cách ly tâm loại bỏ cặn và các chất rắn, dịch sau ly tâm cho hấp phụ trên nhựa cationit ở dạng amôn sau đó tiến hành nhả hấp phụ bằng dung dịch amoniac 0,5-5%. Đun nóng dịch lysine thu được để đuổi amoniac ra, dùng HCl để đưa pH về 5, cô đặc và kết tinh ta thu được các tinh thể màu vàng của monoclohydrate lysine. Chế phẩm này chứa hơn 70% lysine nên được gọi là bán tinh khiết có thể dùng trong thực phẩm.

Từ chế phẩm bán tinh khiết tiến hành kết tinh lại nhiều lần để loại các tạp chất còn lại và chất màu, ta thu được dạng lysine tinh khiết đến 97%, sản phẩm này được dùng trong y học và thực phẩm.

Các hương liệu tổng hợp

Tổng hợp kháng sinh β-lactam