Ứng dụng enzyme trong công nghệ gen.

Để tạo được các phân tư DNA tái tổ hợp cần rất nhiều enzyme, do đó việc thương mại hóa các enzyme dùng trong công nghệ gen đem lại nguồn lợi khổng lồ cho nhiều công ty trên thế giới.

Enzyme cắt hạn chế.

Enzyme cắt hạn chế còn được gọi là Restriction endonuclease (RE) được phát hiện vào năm 1962 bởi W. Arber. Đây là enzyme cắt bên trong phân tư DNA tại vị trí đặt biệt được gọi là trình tự nhận biết. Có ba loại enzyme restriction endonuclease, ba loại này khác nhau về đặc điểm cắt, trong ba loại chỉ có loại hai được sư dụng trong công nghệ gen vì nó cắt không cần cung cấp năng lượng và cắt ngay tại điểm nhận biết do đó dễ xác định vị trí cắt. Các enzyme RE được gọi tên theo nguồn gôc mà nó được phân lập: chữ cái đầu

tiên chỉ tên giông, hai chữ cái kế tiếp chỉ tên loài, một chữ cái (có thể có hoặc không) chỉ tên chủng và một sô La mã chỉ thứ tự lần phân lập. Ví dụ Bam HI ( giông Bacillus, loài amyloliquefacien, chủng Rh, lần phân lập thư nhất).Mỗi RE có một trình tự nhận biết riêng, trình tự nhận biết là một đoạn DNA có cấu tạo palindromic (đôi xứng đảo) từ 4-6 nucleotide, tùy thuộc vị trí cắt mà DNA tạo ra sẽ có đầu sole hay đầu bằng, một sô enzyme RE thông dụng sau đây: Enzyme RE Nguồn gôc phân lập Trình tự nhận

biết Kết quả cắt

EcoRI Escherichia coli 5’G AATTC 3’

3’CTTAA G 5’ 5’G AATTC3’ 3’CTTAA G5’ BamHI Bacillus

amyloliquefacien 5’G GATCC 3’3’CCTAG G5’ 5’GGATCC3’ 3’CCTAG G5’

HindIII Haemophilus influenzae 5’A AGCTT3’ 3’TTCGA A5’

5’A

AGCTT3’ 3’TTCGA Ạ’ HaeIII Haemophilus aegyptius 5’GG CC3’

3’CC GG5’

5’GG CC3’ 3’CC GG5’

Enzyme RE được mệnh danh là chiếc kéo phân tư, nó cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật eucaryote. Nhờ enzyme RE mà DNA được cắt nhỏ dùng làm nguyên liệu cho quá trình tái tổ hợp invitro, ngoài ra enzyme còn được dùng để lập bản đồ giới hạn, dùng trong kỹ thuật phân tích RFLP.

Các enzyme ligase

Nếu enzyme RE được mệnh danh là chiếc kéo phân tư thì enzyme ligase được xem là chất keo phân tư để nôi các mảnh DNA lại với nhau. Các enzyme ligase có nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3’OH của sợi DNA này với gôc phosphate ở đầu 5’ của DNA kia, tùy thuộc vào enzyme ligase mà nó cần năng lượng hoặc không. Các DNA- ligase từ vi khuẩn thì chỉ gắn kết các DNA có đầu so le, còn DNA đầu bằng thường được nôi bởi T4 DNA-ligase.

Ngoài ra còn có các RNA-ligase dùng để nôi các sợi RNA đơn lại với nhau, tuy nhiên RNA-ligase không thông dụng trong công nghệ gen như là DNA- ligase.

Các DNA-polymerase.

DNA-polymerase được phân lập đầu tiên bởi Kornberg vào năm 1958 gọi là DNA-polymerase I, đây là enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp DNA chúng vừa có hoạt tính polymer hóa vừa có hoạt tính exonuclease. Từ DNA- polymerase I, Klenow đã cắt bớt một đoạn peptide trên enzyme tạo ra đoạn

Klenow có hoạt tính cao được sư dụng nhiều trong kỹ thuật PCR. Sau này, người ta phân lập được từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus một enzyme DNA-polymerase có khả năng chịu nhiệt cao đươc gọi là Taq DNA- polymerase, enzyme này thay thế cho enzyme Klenow trong kỹ thuật PCR.

Terminal transferase.

Enzyme này được li trích từ tuyến ức của bê, terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đấu 3’OH tự do của phân tư DNA. Sự gắn kết này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucleotide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ của bôn loại nucleotide có trong môi trường phản ứng. Enzyme này được sư dụng để thêm đuôi vào đầu 3’OH của các DNA đầu bằng tạo đầu so le cho DNA, thuận tiện cho phản ứng nôi DNA, ngoài ra nó còn được dùng để đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương pháp xác định trình tự theo Maxam-Gilbert.

Reverse transcriptase.

Enzyme này còn được gọi là enzyme phiên mã ngược, đây là enzyme do các retro virus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào ký chủ. Hiện nay trên thương trường enzyme phiên mã ngược có nguồn gôc từ AMV (Avian Myeloblastosis Virus) và thông dụng hơn cả là enzyme từ MMLV (Meloney Murine Leukemia Virus) . Từ RNA enzyme phiên mã ngược sẽ xúc tác cho phản ứng tổng hợp c-DNA từ khuôn RNA theo chiều 5’- 3’. Trong công nghệ gen, enzyme này được sư dụng để thiết lập ngân hàng c- DNA; dùng trong phương pháp xác định trình tự của acid nucleic bằng phương pháp dideoxynucleotide của Sanger.

Ngoài những lãnh vực ứng dụng trên đây, enzyme còn được sư dụng trong phân tích thực phẩm, trong công nghiệp khai khoáng .

Ứng dụng enzyme trong công nghệ gen.

Các hương liệu tổng hợp

Tổng hợp kháng sinh β-lactam