3.2.1.Lựa chọn dung môi pha mẫu
Dung môi pha mẫu cần hòa tan tốt dƣợc chất, nhanh chóng và đảm bảo độ ổn định của dƣợc chất trong thời gian phân tích.
PSE và LOR có độ phân cực tƣơng đối rất khác nhau, PSE có độ phân cực lớn trong khi LOR lại kém phân cực. Từ tính chất trên, chúng tôi tiến hành pha PSE chuẩn, LOR chuẩn trong các dung môi: ACN, MeOH. Kết quả nhận thấy các chất tan tốt trong cả hai loại dung môi. Tuy nhiên, MeOH là dung môi rẻ tiền hơn, do đó chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu.
3.2.2.Lựa chọn điều kiện sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu và điều kiện sẵn có pha tĩnh, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký về cột sắc ký, thành phần pha động, tốc độ dòng và bƣớc sóng phát hiện sao cho píc của hai hoạt chất đƣợc tách riêng, đồng thời có thời gian phân tích phù hợp.
3.2.2.1. Cột sắc ký
- Cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) - Cột Zorbax C18 SB (4,6 x 150 mm, 5 µm) - Cột Hypersil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm) ở nhiệt độ khác nhau.
Kết quả cho thấy cột Hypersil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm) ở nhiệt độ 250
C cho thời gian phân tích hợp lý, píc 2 chất tách hoàn toàn, đối xứng, rõ nét, kết quả thể hiện ở hình 3.1 Do đó chúng tôi lựa chọn loại cột này trong nghiên cứu
Hình 3.1: SKĐ khảo sát loại cột sắc ký:
a. Inertsil C18; b. Zorbax C18 SB; c. Hypersil C18 BDS.
3.2.2.2. Pha động và tốc độ dòng
Khảo sát pha động gồm 3 thành phần chính: MeOH, ACN và dung dịch đệm NH
Dung dịch đệm AHP đƣợc pha nhƣ sau: Cân 3,45 g NH4H2PO4 hòa tan trong 1 lít nƣớc, điều chỉnh về pH 3,5 ± 0,05 bằng H3PO4 đặc.
Để lựa chọn đƣợc pha động phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát các hệ pha động khác nhau về tỷ lệ 3 thành phần MeOH, ACN, AHP; có hoặc không có chất tạo cặp; chế độ chạy gradient dung môi, hoặc đẳng dòng.
a.Khảo sát chế độ đẳng dòng
Khảo sát tỷ lệ 3 thành phần trong pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ MeOH: AHP: ACN lần lƣợt là (50:10:40), (50:20:30), (40:30:30), (30:30:40), (25:25:50), (20:20:60), (20:50:30), (20:60:20), (20:70:10), với tốc độ dòng 1ml/phút. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Khảo sát chế độ đẳng dòng
STT Tỷ lệ % thể tích Kết quả MeOH AHP ACN
1 50 10 40
Thời gian rửa giải PSE ngắn.
2 50 20 30
3 20 20 60
4 40 30 30
Píc PSE doãng , không cân đối.
5 30 30 40
6 25 25 50 Thời gian phân tích kéo dài (khoảng 15 phút)
7 20 50 30
Thời gian phân tích kéo dài (trên 25 phút)
8 20 60 20
Ảnh hƣởng của tỷ lệ ACN và MeOH trong pha động lên thời gian lƣu của píc hoạt chất đƣợc tóm tắt qua hình 3.2.
Hình 3.2: Đồ thị biễu diễn sự thay đổi thời gian lưu của píc PSE và LOR khi thay đổi tỷ lệ pha động
Kết quả trên cho thấy, khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ thì thời gian rửa giải của cả 2 chất đều giảm, trong đó ảnh hƣởng tới thời gian lƣu của LOR là rõ rệt hơn. Nếu tỷ lệ của 2 dung môi này lớn hơn 80% thì khả năng lƣu giữ đối với PSE rất thấp (thời gian lƣu nhỏ hơn 1 phút). Trong khi đó nếu tỷ lệ ACN, MeOH giảm dƣới 60% thời gian rửa giải LOR rất dài (19 phút).
b.Khảo sát chương trình gradient dung môi
Nhằm tăng thời gian lƣu của PSE, giảm thời gian lƣu LOR, đảm bảo píc cân đối sắc nét, chúng tôi tiến hành sắc ký với 2 chƣơng trình gradient dung môi ở bảng 3.2, tốc độ dòng 1 ml/phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3
Bảng 3.2: Chƣơng trình dung môi sắc ký
Thời gian (phút)
% thể tích chƣơng trình dung môi
Chƣơng trình 1 Chƣơng trình 2 MeOH AHP ACN MeOH AHP ACN
0 0 85 15 0 85 15 2 0 85 15 0 85 15 5 20 30 50 30 22 48 14 20 30 50 30 22 48 17 0 85 15 0 85 15 19 0 85 15 0 85 15
Hình 3.3: SKĐ mẫu chuẩn với chương trình dung môi: a. Chương trình 1 b. Chương trình 2
Kết quả cho thấy thời gian lƣu của píc PSE và LOR lần lƣợt là 3,4 và 14,0 phút (chƣơng trình 1), 3,4 và 12,8 phút (chƣơng trình 2). Tuy nhiên, độ nhiễu đƣờng nền lớn, các píc có hệ số đối xứng thấp ( khoảng 0,7)
c. Khảo sát thêm chất tạo cặp ion và tốc độ dòng
Do kết quả khảo sát chƣơng trình dung môi không cải thiện nhiều thời gian lƣu, đồng thời làm tăng độ nhiễu đƣờng nền nên chúng tôi lựa chọn thành phần pha động MeOH: AHP: ACN 25:25:50 để tiếp tục nghiên cứu.
Để tăng thời gian lƣu của PSE, chúng tôi tiến hành thêm natri heptansulfonat vào hệ pha động trên với nồng độ 0,005M nhƣng kết quả thu đƣợc cũng không cải thiện đƣợc nhiều (PSE đƣợc rửa giải dƣới 3 phút) (hình 3.4). Mặt khác để giảm chi phí cho nghiên cứu nên chúng tôi không áp dụng sắc ký pha đảo tạo cặp ion.
Hình 3.4: SKĐ chạy đẳng dòng có chất tạo cặp ion
- LOR và PSE có độ phân cực rất khác nhau, với hệ pha động lựa chọn PSE đƣợc rửa giải nhanh (dƣới 2,5 phút) còn píc LOR xuất hiện ở thời gian lớn hơn 13 phút. Để giảm thời gian phân tích, nhƣng vẫn giữ ổn định thành phần pha động, tiến hành sắc ký với chế độ gradient tốc độ dòng pha động trong khoảng từ 1,0 – 1,6 ml/phút (bảng 3.3), kết quả cho thấy thời gian lƣu của píc của PSE không thay đổi (khoảng 2,4 phút), nhƣng píc của LOR xuất hiện ở khoảng 9,7 phút, do đó thời gian phân tích đƣợc rút ngắn xuống còn
Bảng 3.3: Chƣơng trình tốc độ dòng
Thời gian (phút) 0 3,5 6 11 12,5 Lƣu lƣợng dòng (ml/ phút) 1,0 1,0 1,6 1,6 1,0
Nhƣ vậy, sau qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc pha động đơn giản, có thời gian phân tích phù hợp, píc sắc nét, cân đối, với tỷ lệ: ACN: MeOH: AHP = 50:25:25 với chế độ gradient tốc độ dòng trong khoảng 1,0 – 1,6 ml/phút.
3.2.2.3. Bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ hấp thụ UV trong khoảng 200 -300 nm tại thời gian lƣu tƣơng ứng với píc của LOR và PSE. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5
Kết quả cho thấy cực đại hấp thụ của PSE là 215 nm và 257nm, còn LOR có 2 cực đại hấp thụ là 207 nm và 254 nm. Đáp ứng phân tích của LOR ở bƣớc sóng 207 nm gấp khoảng 2 lần so với bƣớc sóng 254 nm, đồng thời do hàm lƣợng LOR trong chế phẩm nhỏ, đáp ứng phân tích của LOR thấp hơn PSE nên cần ƣu tiên sử dụng bƣớc sóng tối ƣu cho LOR. Bên cạnh đó, để tránh ảnh hƣởng của nền mẫu, chúng tôi tiến hành khảo sát tại các bƣớc sóng 210 nm, 220 nm, 230 nm, 240 nm, 257 nm. Kết quả khảo sát cho thấy đáp tại bƣớc sóng 210 nm cho đáp ứng phân tích của LOR và PSE tốt đồng thời không bị ảnh hƣởng bởi dung môi và nền mẫu. Do đó, chúng tôi lựa chọn phát hiện PSE và LOR tại bƣớc sóng 210 nm.
Nhƣ vậy, sau quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký nhƣ sau:
- Cột: Hypersil C18 BDS (250 x 4,6 mm, 5µm), nhiệt độ cột 250C.
- Pha động: ACN: MeOH: dung dịch Amoni dihydrophosphat 0,03M, pH 3,5 = 50:25:25 - Chƣơng trình tốc độ dòng: Thời gian (phút) 0 3,5 6 11 12,5 Lƣu lƣợng dòng (ml/ phút) 1,0 1,0 1,6 1,6 1,0 - Thể tích tiêm: 20 µl. - Bƣớc sóng phát hiện: λ= 210 nm. 3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 3.3.1.Độ thích hợp của hệ thống
độ PSE và LOR lần lƣợt là 120 µg/ml và 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch trên. Ghi lại thời gian lƣu, diện tích píc của PSE và LOR. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả tính thích hợp hệ thống sắc ký của PSE và LOR
STT PSE LOR tR (phút) S (mAu.s) tR (phút) S (mAu.s) 1 2,405 5395,1 9,984 299,4 2 2,348 5375,8 9,554 303,3 3 2,355 5368,4 9,713 300,6 4 2,347 5364,6 9,603 300,0 5 2,351 5393,5 9,678 305,3 6 2,351 5384,7 9,571 302,4 Trung bình 2,360 5380,35 9,684 301,83 SD 0,022 12,814 0,159 2,249 RSD% 0,95 0,24 1,65 0,75
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy thời gian lƣu và diện tích píc của PSE và LOR đều có độ chụm cao thể hiện ở độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD % đều nằm trong khoảng cho phép (< 2%). Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp cho việc định lƣợng đồng thời PSE và LOR.
3.3.2.Độ chọn lọc
Chuẩn bị các dung dịch sắc ký:
-Dung dịch chuẩn LOR: Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc LOR ở mục 3.1.1.1 vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng pha động. Dung dịch này có nồng độ LOR là 5 µg/ml.
-Dung dịch chuẩn PSE: Lấy chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc PSE ở mục 3.1.1.2 vào bình định mức 100 ml và định mức đến vạch bằng pha động. Dung dịch này có nồng độ PSE là 120 µg/ml.
-Mẫu hỗn hợp chuẩn: Lấy chính xác 5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp ở mục 3.1.1.3 vào bình định mức 50 ml và định mức đến vạch bằng pha động. Dung dịch này có nồng độ PSE và LOR lần lƣợt là 120 µg/ml và 5 µg/ml.
-Mẫu placebo: Chuẩn bị nhƣ mục 3.1.2.5.
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trên, ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lƣu, diện tích píc của các chất. Kết quả trình bày ở hình 3.6.
Nhận xét: Kết quả ở hình 3.6 cho thấy píc PSE và LOR có thời gian lƣu lần lƣợt là 2,36 và 9,68 phút, píc gọn, cân đối, không xen phủ píc khác; trên sắc ký đồ mẫu placebo không có píc tại vị trí tƣơng ứng thời gian lƣu của hoạt chất. Do vậy, phƣơng pháp có tính chọn lọc cao.
Hình 3.6: Sắc ký đồ các mẫu thẩm định tính chọn lọc của phương pháp a. PSE chuẩn b. LOR chuẩn c. Hỗn hợp chuẩn d. Mẫu placebo
3.3.3.Độ tuyến tính
Với mục tiêu xây dựng phƣơng pháp có khoảng tuyến tính đủ rộng để ứng dụng đánh giá nhiều chỉ tiêu về hàm lƣợng, chúng tôi tiến hành xây dựng khoảng nồng độ từ 5% đến 125% nồng độ đối với chỉ tiêu định lƣợng.
Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp (phần 3.1.1.3), tiến hành pha các dung dịch chuẩn có nồng độ PSE dự kiến từ 6-170 µg/ml, nồng độ LOR dự kiến từ 0,25 - 6,7 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn và ghi lại diện tích píc. Từ đó xác định mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích píc PSE và LOR với nồng độ tƣơng ứng. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.7
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của PSE và LOR
STT PSE LOR C (µg/ml) S (mAU.s) C(µg/ml) S (mAU.s) 1 167,415 7185,5 6,638 424,7 2 150,673 6531,3 5,974 384,4 3 133,932 5779,8 5,310 342,7 4 117,190 5047,3 4,647 293,1 5 100,449 4335,6 3,983 252,9 6 50,224 2221,4 1,991 127,2 7 25,112 1156,6 0,996 64,9 8 12,556 605,0 0,498 33,9 9 6,278 315,5 0,249 16,9
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của PSE và LOR
Kết quả trên cho thấy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát của PSE và LOR, có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc với nồng độ đối với cả hai hoạt chất, với hệ số hồi quy tuyến tính (r) đều là 0,9999.
3.3.4.Độ chính xác
3.3.4.1. Độ lặp lại
Chuẩn bị mẫu: Thực hiện nhƣ đối với chuẩn bị dung dịch thử đánh giá chỉ tiêu định lƣợng ở mục 3.1.2.1. Tiến hành với 6 mẫu riêng biệt từ cùng một mẫu bột viên. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp STT Khối lƣợng cân (mg) PSE LOR Spíc (mAu.s) HL % Spíc (mAu.s) HL % 1 437,08 5269,2 101,9 322,8 102,7 2 421,2 4908 98,51 302,6 99,92 3 432,9 5149 100,6 313,5 100,7 4 437,2 5188,5 100,3 319,3 101,6 5 441,7 5182,5 99,19 317,1 99,85 6 429,96 5009,2 98,49 310 100,3 Trung bình 99,83 100,8 SD 1,35 1,12 RSD% 1,35 1,11
Khối lƣợng trung bình viên : m= 436,61 mg PSE chuẩn : Sc = 5764,2 mAu.s, mC= 134,2 mg LOR chuẩn: Sc = 333,4 mAu.s, mC= 26,75 mg
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy độ lặp lại các kết quả định lƣợng của PSE và LOR đều có giá trị RSD < 2 %. Điều này chứng tỏ phƣơng pháp có độ lặp lại trong ngày tốt.
3.3.4.2. Độ chính xác khác ngày
Xác định hàm lƣợng PSE và LOR trong mẫu thử Clatadin B ở ngày tiếp theo. Tiến hành tƣơng tự nhƣ xác định độ lặp lại với 6 mẫu độc lập nhƣng ở ngày phân tích khác.
Độ chính xác khác ngày của PSE và LOR trong mẫu thử đƣợc đánh giá trên 12 mẫu trong 2 ngày khác nhau và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp STT Khối lƣợng cân (mg) PSE LOR Spíc (mAu.s) HL % Spíc (mAu.s) HL % 1 492,8 5730,1 100,5 342,3 100,1 2 453,2 5198,6 99,16 319,6 101,6 3 447,6 5103,4 98,56 313,8 101,0 4 460,4 5412 101,6 324,5 101,5 5 493,6 5813,7 101,8 348,4 101,7 6 441,64 5175,2 101,3 305,4 99,63 Trung bình 100,5 100,9 SD 1,35 0,88 RSD % 1,35 0,87 Tính chung 2 ngày TB: 100,2 % %RSD: 1,33 % TB: 100,9 % %RSD: 0,95 %
Khối lƣợng trung bình viên : m= 436,61 mg PSE chuẩn : Sc = 5565,7 mAu.s, mC= 132,5 mg LOR chuẩn: Sc = 312,7 mAu.s, mC= 26,0 mg
Để so sánh giá trị trung bình của hàm lƣợng PSE và LOR trong viên Clatadin B, chúng tôi sử dụng hàm two-sample t-test trên phần mềm Microsoft office Excel 2007. Kết quả giá trị p-value > 0,05 đối với cả hai hoạt chất cho thấy sự khác biệt về hàm lƣợng giữa kết quả của hai ngày là không có ý nghĩa thống kê.
Nhận xét: Độ chính xác trung gian đạt trong khoảng giới hạn (< 3%), cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại giữa các ngày khác nhau tốt.
Nhƣ vậy phƣơng pháp xây dựng đƣợc có độ chính xác cao, đạt yêu cầu cho phép định lƣợng đồng thời hai hoạt chất.
3.3.5.Độ đúng
Thẩm định độ đúng theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền mẫu placebo. Lƣợng chất chuẩn thêm vào ở 3 mức tƣơng đƣơng với 80%, 100%, 120% hàm lƣợng trong viên. Mỗi mức nồng độ làm 3 mẫu độc lập.
Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác lƣợng bột viên placebo tƣơng đƣơng khối lƣợng trung bình viên đã nghiền mịn vào bình định mức 100 ml. Cân chính xác vào mỗi bình đồng thời những lƣợng chất chuẩn sau:
+ Khoảng 96 mg PSE và 4 mg LOR (80% hàm lƣợng trong viên).
+ Khoảng 120 mg PSE và 5 mg LOR (100% hàm lƣợng trong viên).
+ Khoảng 144 mg PSE và 6 mg LOR (120% hàm lƣợng trong viên).
Thêm khoảng 60 ml MeOH, siêu âm trong 15 phút, định mức bằng MeOH đến vạch, lắc đều. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy chính xác 5 ml dịch trong cho vào bình định mức 50 ml, pha loãng bằng pha động đến vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Ghi diện tích píc, xác định độ thu hồi của PSE và LOR, tính RSD%. Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp đƣợc trình bày trong bảng 3.8
Bảng 3.8: Kết quả thẩm định độ đúng của PSE và LOR STT PSE LOR Lƣợng thêm (mg) Spíc (mAU.s) Tìm lại (mg) % Tìm lại Lƣợng thêm (mg) Spíc (mAU.s) Tìm lại (mg) % Tìm lại 1 92,16 4355,5 90,90 98,63 3,80 257,2 3,78 99,47 2 96,79 4680,0 97,67 100,91 4,29 288,1 4,23 98,66 3 94,32 4464,3 93,17 98,78 3,68 250,9 3,69 100,17 4 120,78 5716,6 119,30 98,78 4,82 331,9 4,88 101,30 5 121,20 5853,2 122,15 100,79 5,49 374,5 5,50 100,25 6 119,79 5680,7 118,55 98,97 4,68 320,9 4,72 100,77 7 146,43 6940,4 144,84 98,92 5,87 400,2 5,88 100,23 8 143,93 6862,0 143,21 99,50 6,64 447,8 6,59 99,08 9 140,04 6620,4 138,16 98,66 5,62 386,0 5,67 101,01 Trung bình 99,33 100,10 SD 0,90 0,88 RSD % 0,91 0,88
PSE chuẩn : Sc = 5274,2 mAu.s, mC= 122,3 mg
LOR chuẩn: Sc = 316,1 mAu.s, mC= 26,0 mg
Kết quả cho thấy phƣơng pháp có độ đúng cao với tỷ lệ tìm lại từ 98 %-