- Sinh khả dụng (SKD) in vitro là công cụ kiểm soát chất lƣợng các dạng thuốc rắn để uống (viên nén, viên nang, pellet,…), đặc biệt là đảm bảo sự đồng nhất giữa các lô mẻ sản xuất, giữa các nhà sản xuất.
- SKD in vitro dùng để sàng lọc, định hƣớng, đánh giá SKD in vivo. Việc đánh giá SKD in vivo rất đắt tiền, tốn kém, không thể làm tràn lan do đó trƣớc hết phải dùng SKD in vitro sàng lọc, định hƣớng cho việc thử in vivo để giảm bớt chi phí, thời gian.
- SKD in vitro dùng thay thế cho SKD in vivo trong trƣờng hợp đã chứng minh đƣợc có sự tƣơng quan đồng biến giữa SKD in vitro và SKD in vivo với điều kiện công thức và quy trình sản xuất không thay đổi. Thực ra do
tốn kém nên SKD in vivo chỉ đƣợc đánh giá một lần khi lập hồ sơ xin phép sản xuất, đảm bảo tính ổn định cho SKD in vivo
- Giải phóng dƣợc chất in vitro là công cụ cơ bản để xây dựng công thức, thiết kế dạng thuốc trên cơ sở coi tỷ lệ hòa tan dƣợc chất là thông số chất lƣợng của đầu ra, từ đó lựa chọn dạng thuốc và công thức tối ƣu.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1.Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.1. Chất đối chiếu
Chất chuẩn pseudoephedrin hydrochlorid (hàm lƣợng: 99,9%, độ ẩm 0,1%) đạt tiêu chuẩn BP 2009 do công ty cổ phần dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 cung cấp.
Chất chuẩn loratadin (hàm lƣợng: 99,24%, độ ẩm: 0,02%, số kiểm soát: 0108242) của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng.
2.1.1.2. Chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu
- Chế phẩm thử: Viên phóng thích có kiểm soát Clatadin B chứa PSE.HCl (hàm lƣợng ghi nhãn 120mg) và LOR (hàm lƣợng ghi nhãn 5 mg), chế phẩm này chứa ½ lƣợng PSE và toàn bộ lƣợng LOR giải phóng ngay, ½ lƣợng PSE giải phóng chậm.
Công thức viên bao Clatadin B :
+ Pseudoephedrin hydrochlorid 120 mg
+ Loratadin 5 mg
+ Tá dƣợc vừa đủ 1 viên
- Chế phẩm đối chiếu: Viên phóng thích có kiểm soát Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough) số lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014, hàm lƣợng ghi nhãn PSE sulfat 120mg và LOR 5mg. Hiện tại, chế phẩm này chƣa đƣợc cấp phép lƣu hành tại Việt Nam.
2.1.2.Dung môi, hóa chất
- Acetonitril (ACN), methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức).
- Amoni dihydrophosphat (PA), dung dịch H3PO4 (PA) (Merck – Đức).
- Acid hydrochloric, NaOH, kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat (AR) (Trung Quốc)
- Nƣớc cất hai lần.
2.1.3.Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống máy HPLC – detector UV – DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive (Mỹ) với phần mềm Aligent Chemstation version B.
- Máy siêu âm Ronorex RK 106 (Đức). - Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan).
- Máy ly tâm Hettich (Đức).
- Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh).
- Thiết bị thử độ hoà tan Pharmatests, kết nối với bơm nhu động ISMATEC IPC và bộ phận lấy mẫu tự động Pharmatest PTFC II (Đức).
- Tủ sấy Shellab (Đức).
- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,01 mg). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Pipet tự động 10-100 µl, 100-1000 µl (Đức).
- Các dụng cụ khác: Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, pipet, ống đong, cốc có mỏ, lọ đựng mẫu sắc ký (vial).…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1.Khảo sát điều kiện sắc ký 2.2.1.Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời PSE và LOR gồm:
- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc.
- Pha động: Lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động cho thời gian lƣu píc chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp.
- Detector và bƣớc sóng phát hiện: chọn bƣớc sóng tại đó đáp ứng phân tích của PSE và LOR là tối ƣu.
2.2.2.Thẩm định phƣơng pháp
Thẩm định phƣơng pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát để đảm bảo phƣơng pháp nghiên cứu là phù hợp [5], [18], [22].
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Độ chọn lọc của phƣơng pháp. - Tính tuyến tính và khoảng xác định.
- Độ chính xác : gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian - Độ đúng của phƣơng pháp.
2.2.3.Ứng dụng phƣơng pháp phân tích trong xác định hàm lƣợng viên phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin
Ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng ở trên để đánh giá các tiêu chí về định lƣợng trên viên Clatadin B gồm:
- Độ đồng đều hàm lƣợng (đối với LOR) - Định lƣợng hàm lƣợng
- So sánh độ hòa tan in vitro với chế phẩm đối chiếu là viên Clarinase (Schering-Plough)
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC
2.3.1.1. Lựa chọn điều điện sắc ký
Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn đƣợc loại cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bƣớc sóng phát hiện đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, píc gọn, thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng phân tích là tối ƣu cho 2 hoạt chất.
- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát trên 3 loại cột sắc ký pha đảo C18 của các hãng, gồm : cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), cột Zorbax C18 SB (4,6 x 150 mm, 5 µm), cột Hypesil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm).
- Lựa chọn pha động: Tham khảo các tài liệu, chúng tôi khảo sát trên dung môi pha động gồm MeOH, ACN và dung dịch đệm NH4H2PO4 30 mM pH 3,5 với các tỷ lệ khác nhau, có hoặc không có chất tạo cặp; chế độ pha động đẳng dòng hoặc gradient; thay đổi hoặc giữ nguyên tốc độ dòng trong quá trình sắc ký.
- Lựa chọn bƣớc sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của PSE và LOR để xác định bƣớc sóng định lƣợng là tối ƣu nhất.
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp
-Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lƣu và diện tích píc của các lần sắc ký.
-Yêu cầu: chênh lệch diện tích píc, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) không lớn hơn 2%.
b. Tính chọn lọc của phương pháp
-Tạo mẫu trắng với các thành phần tá dƣợc tƣơng tự nhƣ trong chế phẩm nhƣng không có hoạt chất PSE và LOR (mẫu placebo). Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu placebo. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện nhƣ mẫu thử.
-Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu đƣợc, tại thời điểm tƣơng ứng píc của PSE và LOR không đƣợc xuất hiện píc lạ.
c. Tính tuyến tính và khoảng xác định (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Tiến hành xác lập mối tƣơng quan giữa diện tích píc với nồng độ PSE và LOR. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn PSE và LOR có nồng độ tăng dần. Tiến hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.
-Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị r 0,995.
d. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dƣới những điều kiện mô tả.
-Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lƣợng): xác định độ lặp lại của phƣơng pháp bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu chế phẩm. Ghi sắc ký đồ, diện tích píc của hai hoạt chất. Tính hàm lƣợng của PSE và LOR trong mẫu thử. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD. Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD phải không lớn hơn 2%.
-Độ chính xác khác ngày: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm đƣợc thức hiện ở các ngày khác nhau. Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD trong ngày phải không lớn hơn 2% và trong hai ngày phải không lớn hơn 3%.
e. Độ đúng của phương pháp
-Xác định độ đúng của phƣơng pháp bằng phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo. Lƣợng chất chuẩn thêm vào tƣơng ứng với khoảng 80 %, 100 %, 120 % lƣợng hoạt chất có trong mẫu thử. Ở mỗi mức thêm, tiến hành với 3 lần thử nghiệm riêng biệt.
-Tính tỷ lệ thu hồi của PSE và LOR chuẩn thêm vào mẫu thử. -Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0 – 102,0 %
2.3.2.Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Pseudoephedrin và Loratadin trong viên phóng thích có kiểm soát trong viên phóng thích có kiểm soát
2.3.2.1. Độ đồng đều hàm lượng
Tiến hành theo chuyên luận “Độ đồng đều hàm lƣợng” của DĐVN 4. Xác định hàm lƣợng LOR trong 10 viên (làm riêng rẻ) theo phƣơng pháp định lƣợng đã xây dựng. Tính hàm lƣợng trung bình của LOR trong 10 viên. Kết quả đạt nếu không có viên nào có hàm lƣợng LOR nằm ngoài khoảng 85 % đến 115 % hàm lƣợng trung bình.
Nếu có 1 viên có giá trị hàm lƣợng LOR nằm ngoài khoảng 85 %-115 % nhƣng nằm trong khoảng 75 %-125 % của hàm lƣợng trung bình thì tiến hành thử lại với 20 viên khác. Kết quả là đạt nếu có không quá 1 viên trong số 30 viên thử có hàm lƣợng LOR nằm ngoài khoảng 85 %-115 % nhƣng nằm trong khoảng 75 %-125 % của hàm lƣợng trung bình[1].
2.3.2.2. Định lượng
Xác định hàm lƣợng PSE và LOR trong chế phẩm thử bằng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời PSE và LOR đã xây dựng ở trên.
Cân chính xác 20 viên, tính khối lƣợng trung bình viên. Nghiền mịn. Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 120 mg PSE cho vào bình định mức 100,00 ml, thêm khoảng 60 ml MeOH, siêu âm trong 15 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Ly tâm 5000 vòng/phút. Lấy chính xác 10 ml dịch trong ở trên cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng bằng pha động đến vừa đủ thể tích. Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Tiến hành lặp lại 3 lần. Song song làm một mẫu chuẩn có cùng nồng độ.
Tính hàm lƣợng mỗi hoạt chất trong chế phẩm dựa vào diện tích píc của PSE và LOR trong sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn và lƣợng PSE và LOR trong mẫu chuẩn.
Yêu cầu : Hàm lƣợng trung bình của LOR nằm trong khoảng 90 % - 110 % và hàm lƣợng trung bình của PSE nằm trong khoảng 95 % - 105 % [1].
2.3.2.3. Độ hòa tan
a. Phương pháp thử
-Môi trƣờng hòa tan: 2 môi trƣờng : dung dịch HCl 0,1N (dịch dạ dày pH 1,0) và dung dịch đệm hydrophosphat – dihydrophosphat pH 8,2 0,05, thêm enzym trypsin với nồng độ 0,05g/l (dịch ruột). Môi trƣờng đệm pH 8,2 đƣợc pha bằng cách hòa tan 0,523 g kali dihydrophosphat và 16,73 g dikali hydrophosphat trong nƣớc vừa đủ 1000 ml. Chế phẩm đƣợc thử trong môi trƣờng dịch dạ dày ở giờ thứ nhất, sau đó chuyển sang môi trƣờng dịch ruột.
-Tốc độ khuấy: 100 vòng/phút.
-Xác định phần trăm LOR và PSE giải phóng trong môi trƣờng dịch dạ dày sau 1h, phần trăm PSE giải phóng trong môi trƣờng dịch ruột tại giờ thứ 2, thứ 5 và thứ 6 bằng phƣơng pháp định lƣợng đã xây dựng [24].
b. Yêu cầu
Lƣợng dƣợc chất giải phóng tại các thời điểm phải đạt yêu cầu ở bảng 2.1 [24]
Bảng 2.1: Yêu cầu về độ hòa tan của chế phẩm Clatadin B Phần trăm LOR
giải phóng
Phần trăm PSE giải phóng
Giai đoạn môi trƣờng dịch vị
Giờ 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
85 % 60 %
Giai đoạn môi trƣờng dịch ruột
Giờ 2 65 %
Giờ 5 65 %
Giờ 6 85 %
2.3.2.4. Đánh giá giải phóng hoạt chất in vitro viên phóng thích có kiểm soát chứa PSE và LOR
Viên thử và viên đối chiếu đƣợc đánh giá độ hòa tan trong 3 môi trƣờng : đệm pH 1,2 ; đệm pH 4,5 và đệm pH 6,8. Mỗi môi trƣờng thử 12 viên.
- Thiết bị : Máy đo độ hòa tan Pharmatest kiểu cánh khuấy kết nối với bơm nhu động ISMATEC IPC và bộ phận lấy mẫu tự động Pharmatest PTFC II.
- Thể tích môi trƣờng: 900mL. - Chuẩn bị môi trƣờng:
o Dung dịch đệm pH 1,2: Hòa tan 2,0 g NaCl vào 200 ml nƣớc và thêm 7ml dung dịch HCl đậm đặc, thêm nƣớc vừa đủ 1000 ml, chỉnh về pH 1,2 bằng HCl.
o Dung dịch đệm pH 4,5: Hòa tan 6,805 g kali dihydrophosphat trong nƣớc vừa đủ 1000 ml, chỉnh đến pH 4,5 bằng acid phosphoric.
o Dung dịch đệm pH 6,8: Hòa tan 6,805 g kali dihydrophosphat và
0,896 g NaOH trong 900 ml nƣớc, khuấy tan rồi thêm nƣớc vừa đủ 1000 ml, điều chỉnh về pH 6,8 bằng dung dịch NaOH 1M. - Tốc độ khuấy : 100 vòng/phút.
- Nhiệt độ : 37 0,5 0C.
- Thời gian thử : 12h, lấy mẫu định lƣợng tại các thời điểm 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12h.
- Mẫu đƣợc lọc qua màng 0,45μm và định lƣợng đồng thời PSE và LOR bằng phƣơng pháp HPLC.
- Xây dựng đồ thị giải phóng hoạt chất của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu.
- Xác định giá trị RSD của % giải phóng hoạt chất của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu ở các thời điểm lấy mẫu. Đánh giá mức độ tƣơng đồng của đồ thị giải phóng hoạt chất hai chế phẩm qua hệ số f2. [19]
2.3.3.Tính toán và xử lý số liệu
- Đối với chỉ tiêu định lƣợng: Hàm lƣợng PSE và LOR so với lƣợng ghi trên nhãn đƣợc tính bằng phƣơng pháp so sánh với chuẩn có nồng độ tƣơng đƣơng làm song song (phƣơng pháp chuẩn hóa một điểm).
Công thức tính : %Hàm lƣợng = mC × H × (1- w) × c C C t t t f V S f V S × B m m t ×100% Trong đó:
mt, mc (mg): khối lƣợng mẫu thử, mẫu chuẩn.
H: Hàm lƣợng % của PSE / LOR chuẩn. w: hàm ẩm của PSE / LOR chuẩn
St, Sc (mAu.s): diện tích píc PSE / LOR trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn.
Vt, Vc (ml): thể tích khi chuẩn bị dung dịch gốc PSE / LOR trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
ft, fc : hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn.
m(mg): Khối lƣợng trung bình viên Clatadin B.
- Đối với chỉ tiêu độ đồng đều hàm lƣợng: Hàm lƣợng LOR so với lƣợng ghi trên nhãn đƣợc tính bằng phƣơng pháp so sánh với chuẩn có nồng độ tƣơng đƣơng làm song song (phƣơng pháp chuẩn hóa một điểm).
Công thức tính : % Hàm lƣợng = mC × H × (1- w) × c C C t t t f V S f V S × B % 100
- Đối với đánh giá độ hoà tan và độ hòa tan in vitro: Lƣợng PSE và LOR giải phóng đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích. Công thức : % hoạt chất giải phóng = a b St ) ( ×Vt ×ft× B % 100 Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a, b : hệ số trong phƣơng trình đƣờng chuẩn S=a×C +b
- Đánh giá mức độ tƣơng đồng đồ thị giải phóng dƣợc chất in vitro của hai chế phẩm:
Mức độ tƣơng đồng của hai đồ thị giải phóng hoạt chất đƣợc đánh giá qua thông qua chỉ số f2 và đƣợc tính nhƣ sau :
n T R f t t 2 2 ) ( 1 100 log 50
Rt là % dƣợc chất giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu (viên Clarinase repetabs)
Tt là % dƣợc chất giải phóng tại thời điểm t của mẫu thử (viên Clatadin B)
Hai đồ thị đƣợc coi là tƣơng tự nhau nếu f2 nằm trong khoảng 50 100 - Số liệu đƣợc xử lý trên Microsoft Office Excel 2007.
Một số công thức tính các giá trị thống kê
Giá trị trung bình n i i x n x 1