Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC
2.3.1.1. Lựa chọn điều điện sắc ký
Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn đƣợc loại cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bƣớc sóng phát hiện đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, píc gọn, thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng phân tích là tối ƣu cho 2 hoạt chất.
- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát trên 3 loại cột sắc ký pha đảo C18 của các hãng, gồm : cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), cột Zorbax C18 SB (4,6 x 150 mm, 5 µm), cột Hypesil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm).
- Lựa chọn pha động: Tham khảo các tài liệu, chúng tôi khảo sát trên dung môi pha động gồm MeOH, ACN và dung dịch đệm NH4H2PO4 30 mM pH 3,5 với các tỷ lệ khác nhau, có hoặc không có chất tạo cặp; chế độ pha động đẳng dòng hoặc gradient; thay đổi hoặc giữ nguyên tốc độ dòng trong quá trình sắc ký.
- Lựa chọn bƣớc sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của PSE và LOR để xác định bƣớc sóng định lƣợng là tối ƣu nhất.
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp
-Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lƣu và diện tích píc của các lần sắc ký.
-Yêu cầu: chênh lệch diện tích píc, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) không lớn hơn 2%.
b. Tính chọn lọc của phương pháp
-Tạo mẫu trắng với các thành phần tá dƣợc tƣơng tự nhƣ trong chế phẩm nhƣng không có hoạt chất PSE và LOR (mẫu placebo). Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu placebo. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện nhƣ mẫu thử.
-Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu đƣợc, tại thời điểm tƣơng ứng píc của PSE và LOR không đƣợc xuất hiện píc lạ.
c. Tính tuyến tính và khoảng xác định
-Tiến hành xác lập mối tƣơng quan giữa diện tích píc với nồng độ PSE và LOR. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn PSE và LOR có nồng độ tăng dần. Tiến hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.
-Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị r 0,995.
d. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dƣới những điều kiện mô tả.
-Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lƣợng): xác định độ lặp lại của phƣơng pháp bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu chế phẩm. Ghi sắc ký đồ, diện tích píc của hai hoạt chất. Tính hàm lƣợng của PSE và LOR trong mẫu thử. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD. Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD phải không lớn hơn 2%.
-Độ chính xác khác ngày: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm đƣợc thức hiện ở các ngày khác nhau. Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD trong ngày phải không lớn hơn 2% và trong hai ngày phải không lớn hơn 3%.
e. Độ đúng của phương pháp
-Xác định độ đúng của phƣơng pháp bằng phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo. Lƣợng chất chuẩn thêm vào tƣơng ứng với khoảng 80 %, 100 %, 120 % lƣợng hoạt chất có trong mẫu thử. Ở mỗi mức thêm, tiến hành với 3 lần thử nghiệm riêng biệt.
-Tính tỷ lệ thu hồi của PSE và LOR chuẩn thêm vào mẫu thử. -Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0 – 102,0 %