1.2.1.Nguyên tắc và phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao.
Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân, chất lỏng đƣợc bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phƣơng tiện sắc ký mà ngƣời ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau : Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc ký lỏng phân bố đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay [4], [6], [7].
1.2.2.Các thông số đặc trƣng
1.2.2.1. Thời gian lưu ( tR )
Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lƣu phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thƣớc, độ xốp, cấu trúc xốp của hạt nhồi.
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
- Trong một số trƣờng hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hƣởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký [4], [6], [7], [9], [32].
1.2.2.2. Hệ số phân bố K
Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. M S C C K
Trong đó: CS: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh. CM: là nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [4], [6], [7], [9], [32].
1.2.2.3. Hệ số dung lượng k’
Là đại lƣợng cho ta biết tỷ số khối lƣợng của chất tan phân bố vào pha tĩnh và pha động.
t t V
Trong đó: K : hệ số phân bố
VS, VM : thể tích pha tĩnh và pha động
tR, tM : thời gian lƣu của chất cần phân tích và chất không lƣu giữ
Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1≤ k’≤8. [4], [6], [7], [9], [32]
1.2.2.4. Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của píc ta dùng hệ số đối xứng
F
a W
2
Trong đó:
W: chiều rộng píc đo ở 1/20 chiều cao píc.
a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh píc đến mép đƣờng cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao píc [4], [6], [7], [9], [32].
1.2.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký
2 2 / 1 2 2 2 54 , 5 16 W t W t N R R
Trong đó: W: Chiều rộng đo ở đáy píc.
Nếu N quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, nếu N quá lớn thì các píc sắc ký tách quá xa nhau, rửa giải tốn nhiều dung môi. Theo thực tế, trong hầu hết các hỗn hợp mẫu, N nằm trong khoảng 3500-7500 cho 1 mét cột là vừa đủ [4], [6], [7], [9], [32].
Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết đƣợc tính bằng công thức:
H=
N L
1.2.2.6. Độ phân giải RS
Để đánh giá độ tách của các chất đƣợc rửa giải liên tiếp nhau trong một hệ pha, ngƣời ta dùng đại lƣợng độ phân giải RS.
A B RA RB A B RA RB S W W t t W W t t R 2 / 1 2 / 1 ) ( 18 , 1 ) ( 2 Trong đó:
tRA , tRB: thời gian lƣu của 2 píc liền kề nhau (của chất A và B) (phút hoặc giây).
WA, WB: độ rộng píc đo ở các đáy píc (phút hoặc giây).
W1/2A, W1/2B: độ rộng píc đo ở nửa chiều cao píc (phút hoặc giây). Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ƣu RS = 1,5 [4], [6], [7], [9], [32].
1.2.3.Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng hay đƣợc sử dựng trong sắc ký là :
+ Phƣơng pháp chuẩn ngoại : là phƣơng pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện. Kết quả của chất chƣa đƣợc biết đƣợc tính toán so với mẫu chuẩn đã biết nồng độ và đáp ứng của chất phân tích ( diện tích hay chiều cao píc) của mẫu chuẩn và mẫu thử.
+ Phƣơng pháp chuẩn nội : thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lƣợng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất đƣợc thêm này gọi là chuẩn nội. Từ những dữ kiện về diện tích (chiều cao) píc và nồng độ của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định đƣợc hàm lƣợng của thành phần cần định lƣợng trong mẫu thử.
+ Phƣơng pháp thêm chuẩn : chủ yếu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hƣởng của các chất phụ (ví dụ : tá dƣợc). Dung dịch mẫu thử đƣợc thêm vào một lƣợng xác định chất chuẩn. Các píc thu đƣợc của hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải đƣợc đo trong cùng điều kiện sắc ký. Kết quả đƣợc tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lƣợng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích hoặc chiều cao píc.
+ Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích : nồng độ của mẫu thử đƣợc tính toán dựa trên diện tích píc tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích píc chất thử trên tổng diện tích toàn bộ píc có trong sắc ký đồ. Trong HPLC, phƣơng pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là nhƣ nhau, nếu không nhƣ nhau khi đó với mỗi chất cần có một hệ số hiệu chỉnh [4],[6].
1.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN IN VITRO
1.3.1.Khái niệm
Đánh giá độ hòa tan in vitro (hay sinh khả dụng in vitro, giải phóng hoạt chất in vitro) là đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dƣợc chất từ dạng thuốc vào môi trƣờng hòa tan mô phỏng nhƣ môi trƣờng sinh học trong cơ thể ngƣời (nhiệt độ, pH, nhu động,…) và bắt đầu đƣợc đƣa vào dƣợc điển Mỹ 18 dƣới dạng chuyên luận Thử hòa tan (Dissolution test) khi có một loạt công trình nghiên cứu công bố sự liên quan giữa tốc độ hòa tan và tác dụng của thuốc. Hai thiết bị thử độ hòa tan phổ biến nhất là thiết bị giỏ quay và cánh khuấy dùng cho viên nén, viên nang và một số dạng thuốc khác [38].
1.3.2.Phƣơng pháp thử
- Thiết bị : máy thử độ hòa tan thích hợp.
- Môi trƣờng hòa tan : Tùy theo đặc điểm hòa tan của dƣợc chất, khi cần có thể dùng đệm phosphat pH 4-8 hoặc acid hydrocloric loãng (0,001- 0,1M). Dung tích thƣờng dùng 500-1000ml (không nhỏ hơn 3 lần độ bão hòa của dƣợc chất). Một số chất làm tăng độ tan có thể cho vào môi trƣờng hòa tan (nhƣ chất diện hoạt).
- Thời gian thử : tùy từng chế phẩm đối với viên phóng thích có kiểm soát
- Tốc độ khuấy : từ 50-100 vòng/phút.
- Phƣơng pháp định lƣợng : tùy vào đặc tính của dƣợc chất có thể dùng các phƣơng pháp khác nhau, thƣờng dùng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS, HPLC…
Xây dựng đồ thị giải phóng hoạt chất của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu. So sánh đồ thị giải phóng của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu, mức độ tƣơng đồng của hai mô hình giải phóng đƣợc đánh giá thông qua chỉ số f2 và đƣợc tính nhƣ sau : n T R f t t 2 2 ) ( 1 100 log 50
Trong đó : n là số điểm lấy mẫu
Rt và Tt là % dƣợc chất giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu và mẫu thử
Hai đồ thị đƣợc coi là tƣơng tự nhau nếu f2 nằm trong khoảng 50 100 [38].
1.3.3.Ý nghĩa của giải phóng dƣợc chất in vitro
- Sinh khả dụng (SKD) in vitro là công cụ kiểm soát chất lƣợng các dạng thuốc rắn để uống (viên nén, viên nang, pellet,…), đặc biệt là đảm bảo sự đồng nhất giữa các lô mẻ sản xuất, giữa các nhà sản xuất.
- SKD in vitro dùng để sàng lọc, định hƣớng, đánh giá SKD in vivo. Việc đánh giá SKD in vivo rất đắt tiền, tốn kém, không thể làm tràn lan do đó trƣớc hết phải dùng SKD in vitro sàng lọc, định hƣớng cho việc thử in vivo để giảm bớt chi phí, thời gian.
- SKD in vitro dùng thay thế cho SKD in vivo trong trƣờng hợp đã chứng minh đƣợc có sự tƣơng quan đồng biến giữa SKD in vitro và SKD in vivo với điều kiện công thức và quy trình sản xuất không thay đổi. Thực ra do
tốn kém nên SKD in vivo chỉ đƣợc đánh giá một lần khi lập hồ sơ xin phép sản xuất, đảm bảo tính ổn định cho SKD in vivo
- Giải phóng dƣợc chất in vitro là công cụ cơ bản để xây dựng công thức, thiết kế dạng thuốc trên cơ sở coi tỷ lệ hòa tan dƣợc chất là thông số chất lƣợng của đầu ra, từ đó lựa chọn dạng thuốc và công thức tối ƣu.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1.Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.1. Chất đối chiếu
Chất chuẩn pseudoephedrin hydrochlorid (hàm lƣợng: 99,9%, độ ẩm 0,1%) đạt tiêu chuẩn BP 2009 do công ty cổ phần dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 cung cấp.
Chất chuẩn loratadin (hàm lƣợng: 99,24%, độ ẩm: 0,02%, số kiểm soát: 0108242) của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng.
2.1.1.2. Chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu
- Chế phẩm thử: Viên phóng thích có kiểm soát Clatadin B chứa PSE.HCl (hàm lƣợng ghi nhãn 120mg) và LOR (hàm lƣợng ghi nhãn 5 mg), chế phẩm này chứa ½ lƣợng PSE và toàn bộ lƣợng LOR giải phóng ngay, ½ lƣợng PSE giải phóng chậm.
Công thức viên bao Clatadin B :
+ Pseudoephedrin hydrochlorid 120 mg
+ Loratadin 5 mg
+ Tá dƣợc vừa đủ 1 viên
- Chế phẩm đối chiếu: Viên phóng thích có kiểm soát Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough) số lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014, hàm lƣợng ghi nhãn PSE sulfat 120mg và LOR 5mg. Hiện tại, chế phẩm này chƣa đƣợc cấp phép lƣu hành tại Việt Nam.
2.1.2.Dung môi, hóa chất
- Acetonitril (ACN), methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức).
- Amoni dihydrophosphat (PA), dung dịch H3PO4 (PA) (Merck – Đức).
- Acid hydrochloric, NaOH, kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat (AR) (Trung Quốc)
- Nƣớc cất hai lần.
2.1.3.Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống máy HPLC – detector UV – DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive (Mỹ) với phần mềm Aligent Chemstation version B.
- Máy siêu âm Ronorex RK 106 (Đức). - Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan).
- Máy ly tâm Hettich (Đức).
- Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh).
- Thiết bị thử độ hoà tan Pharmatests, kết nối với bơm nhu động ISMATEC IPC và bộ phận lấy mẫu tự động Pharmatest PTFC II (Đức).
- Tủ sấy Shellab (Đức).
- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,01 mg).
- Pipet tự động 10-100 µl, 100-1000 µl (Đức).
- Các dụng cụ khác: Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, pipet, ống đong, cốc có mỏ, lọ đựng mẫu sắc ký (vial).…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1.Khảo sát điều kiện sắc ký 2.2.1.Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời PSE và LOR gồm:
- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc.
- Pha động: Lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động cho thời gian lƣu píc chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp.
- Detector và bƣớc sóng phát hiện: chọn bƣớc sóng tại đó đáp ứng phân tích của PSE và LOR là tối ƣu.
2.2.2.Thẩm định phƣơng pháp
Thẩm định phƣơng pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát để đảm bảo phƣơng pháp nghiên cứu là phù hợp [5], [18], [22].
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Độ chọn lọc của phƣơng pháp. - Tính tuyến tính và khoảng xác định.
- Độ chính xác : gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian - Độ đúng của phƣơng pháp.
2.2.3.Ứng dụng phƣơng pháp phân tích trong xác định hàm lƣợng viên phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin
Ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng ở trên để đánh giá các tiêu chí về định lƣợng trên viên Clatadin B gồm:
- Độ đồng đều hàm lƣợng (đối với LOR) - Định lƣợng hàm lƣợng
- So sánh độ hòa tan in vitro với chế phẩm đối chiếu là viên Clarinase (Schering-Plough)
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC
2.3.1.1. Lựa chọn điều điện sắc ký
Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn đƣợc loại cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bƣớc sóng phát hiện đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, píc gọn, thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng phân tích là tối ƣu cho 2 hoạt chất.
- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát trên 3 loại cột sắc ký pha đảo C18 của các hãng, gồm : cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), cột Zorbax C18 SB (4,6 x 150 mm, 5 µm), cột Hypesil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm).
- Lựa chọn pha động: Tham khảo các tài liệu, chúng tôi khảo sát trên dung môi pha động gồm MeOH, ACN và dung dịch đệm NH4H2PO4 30 mM pH 3,5 với các tỷ lệ khác nhau, có hoặc không có chất tạo cặp; chế độ pha động đẳng dòng hoặc gradient; thay đổi hoặc giữ nguyên tốc độ dòng trong quá trình sắc ký.
- Lựa chọn bƣớc sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của PSE và LOR để xác định bƣớc sóng định lƣợng là tối ƣu nhất.
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp
-Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lƣu và diện tích píc của các lần sắc ký.
-Yêu cầu: chênh lệch diện tích píc, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) không lớn hơn 2%.
b. Tính chọn lọc của phương pháp
-Tạo mẫu trắng với các thành phần tá dƣợc tƣơng tự nhƣ trong chế phẩm nhƣng không có hoạt chất PSE và LOR (mẫu placebo). Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu placebo. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện nhƣ mẫu thử.
-Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu đƣợc, tại thời điểm tƣơng ứng píc của PSE và LOR không đƣợc xuất hiện píc lạ.
c. Tính tuyến tính và khoảng xác định
-Tiến hành xác lập mối tƣơng quan giữa diện tích píc với nồng độ PSE và LOR. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn PSE và LOR có nồng độ tăng dần. Tiến hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.
-Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị r 0,995.
d. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dƣới những điều kiện mô tả.
-Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lƣợng): xác định độ lặp lại của phƣơng pháp bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu chế phẩm. Ghi sắc ký đồ, diện tích píc của hai hoạt chất. Tính hàm lƣợng