Sử dụng phƣơng pháp pha loãng liên tục
Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị môi trường MRS thạch như trong mục 2.3.1. Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115oC trong 20 phút. Phân phối thạch đều lên các đĩa petri đã hấp tiệt khuẩn, sao cho thạch phủ kín bề mặt. Bề dày lớp thạch trên đĩa khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng. Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại.
Chuẩn bị các ống nghiệm, hút 9,0ml dung dịch pepton 0,1% (kl/tt) vào mỗi ống, đậy kín. Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 37 - 40o
C.
Chuẩn bị mẫu nguyên liệu vi nang:
Mẫu vi nang sau đông khô: Đong 100,0ml dung dịch natri citrat 0,1M vào bình nón, hấp tiệt khuẩn, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang đông khô vào bình nón. Khuấy từ với tốc độ 500 rpm trong khoảng 15 phút đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất [13].
Mẫu vi nang trước đông khô: Sau khi tạo hạt, rửa 2 lần với dung dịch nước muối NaCl 0,9%, gạn vi nang trên rây, để ráo nước, dùng giấy thấm khô bề mặt, cân chính xác 1,00g vi nang, tiến hành như đối với vi nang sau đông khô.
Tiến hành
Hút chính xác 1,00ml hỗn dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào từ bình nón cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9,0ml dung dịch pepton 0,1% đã chuẩn bị ở trên, lắc đều. Sau đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đã đồng nhất từ ống nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng. Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa này trong tủ ấm CO2 5%, ở nhiệt độ 37oC, sau 48 giờ đọc kết quả. Chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300. Số lượng vi sinh vật có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức [6]:
1 2 1 2 10 10 10 2 3 n n n n n n A A A X m Trong đó:
X: là số lượng vi sinh vật có trong 1g (hoặc 1ml) mẫu.
An-1, An, An+1: là số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có nồng độ pha loãng tương ứng 10n-1
, 10n, 10n+1.
m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng.