3.3.6. Đề xuất biện pháp khống chế ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm vi khuẩn.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO).
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm
- Thu thập mẫu thịt lợn theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt. - Dụng cụ lấy mẫu, vật chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt.
- Lấy mẫu thịt: Khử trùng dao bằng cồn 700C, sau đó dùng dao cắt lấy 100 - 200 gram thịt/mẫu rồi cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết. Các mẫu thịt lợn sau khi lấy phải bảo đảm không lẫn nhau. Sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 0 - 20C và phải kiểm tra trong vòng 24 giờ.
3.4.2. Quy trình kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật có trong thịt lợn tươi
Quy trình kỹ thuật áp dụng đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt lợn tươi được áp dụng theo TCVN 7046:2002 [16].
Bảng 3.1: Tiêu chuẩn vi sinh vật của thịt lợn tươi (TCVN 7046:2002) [16]
TT Tên chỉ tiêu Giới hạn
tối đa
1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 106 2 E.coli, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102 3 Salmonella, số vi khuẩn trong 25g sản phẩm 0 4 Baccillus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102 5 Staphylococcus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102 6 Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 10 7 Clostridium botulium, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 0
3.4.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt lợn tươi
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt lợn tươi áp dụng theo TCVN 5156:1990 [15].
* Xác định chỉ tiêu Staphylococcus aureus trong 10g thịt lợn tươi trên môi trường thạch Chapman Stone
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhuyễn. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 10g mẫu cho vào bình tam giác 100ml, bổ sung 90ml nước muối sinh lý, được pha loãng 10-1
- 10-4.
- Dùng que cấy thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn vớigiống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch Chapman Stone - một loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn Staphylococcus aureus. Sau đó nuôi dưỡng ở 370
C/24h.
- Đếm số khuẩn lạc nghi Staphylococcus aureus (khuẩn lạc có dạng S trơn, nhẵn bề mặt vồng, rìa gọn, tròn màu vàng, xung quanh có vùng dung huyết).
- Từ môi trường ta đã phân lập ở trên, chọn khuẩn lạc Staphylococcus
aureus nghi ngờ đem giám định đặc tính vi sinh vật hóa học: kiểm tra hình thái, kích thước, tính chất bắt màu Gram, phản ứng sinh Indol 450
C (+), H2S, urease (-), MR(+) , VP (-), Citrate (-), coagulase, phản ứng lên men đường…
Xác định khả năng sinh sản độc tố, độc lực, các yếu tố gây bệnh... Công thức tính số lượng vi khuẩn (CFU/g):
N = d n n C ) 1 , 0 ( 1 + 2 ∑
ΣC:là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1:là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc. n2:là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc. d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
3.4.4. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu chúng tôi tiến hành nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắt màu của vi khuẩn. Dùng bút sáp để ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm lên phiến kính chuẩn bị phết vi khuẩn.
Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính. Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trên phiến kính. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn. Sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (tránh không để tiêu bản quá nóng).
+ Nhỏ một giọt dung dịch Gentian lên lam kính để lưu lại trong thời gian 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
+ Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch Lugol lên lam kính trong thời gian 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Tẩy màu nhanh bằng cồn Axeton trong vòng 15 - 20 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất.
+ Nhỏ 1 giọt dung dịch Fushin lên lam kính sau thời gian 2 phút. Sau rửa lại bằng nước cất.
Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên. Nhỏ một giọt dầu bạch dương lên phiến kính, quan sát hình thái, và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100).
3.4.5. Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Staphylococcus aureus đã phân lập được đã phân lập được
Từ môi trường đã phân lập ở trên, chọn khuẩn lạc S.aureus nghi ngờ để kiểm tra hình thái, kích thước: có hình cầu, đường kính khoảng từ 0.8 – 1.5 µm, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (+).
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho S.aureus là: tính di động, phản ứng lên men đường manitol (+), glucose (+), galactose (-), sucrose (+), phản ứng sinh Indol 450
C (+), H2S; urease (-), MR (+), VP (-), Citrate (-), coagulase (+), catalase (+).
- Phản ứng Catalase: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
- Thử nghiệm Coagulase (đông tụ huyết tương): Bằng phản ứng đông tụ huyết tương thỏ
Đây là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh bằng cách cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương thỏ và 0,5ml dịch cấy vi khuẩn. Ủ ấm 370
C/4 - 24h.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không thấy xuất hiện khối đông tụ là phản ứng âm tính.
- Kiểm tra khả năng sinh Indol của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã cấy thuần vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có). Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ giọt 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’
s vào ống nghiệm.
+ Phản ứng dương tính: Trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’
s màu café và Indol không màu).
+ Phản ứng âm tính: Không có sự thay đổi màu.
- Lên men đường manitol: Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống canh thang peptone có đường, để tủ ấm 370C sau 24 h đọc kết quả.
+ Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu. + Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu đỏ.
- Thử nghiệm khả năng di động: Phát hiện khả năng di động của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu.
Cách tiến hành: Cấy đâm sâu trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 370C từ 18 - 24h.
+ Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch.
- Thử nghiệm khả năng dung huyết: Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy trên thạch máu. Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có 3 dạng tan máu:
+ Tan máu (β): Vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. + Tan máu (α): Vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc. + Tan máu (γ): Không có vùng tan máu.
3.4.6. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S.aureus
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy và phân lập trên môi trường Chapman Stone, cho vào các ống nghiệm chứa môi trường BHI đã pha chế, đem nuôi trong tủ ấm 370
C/24h.
Sau đó tiến hành tiêm xoang phúc mạc chuột bạch với liều 0,5ml canh trùng/con. Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm. Khi chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn trên môi trường Chapman Stone.
Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng 0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất. Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích rồi phân lập lại trên môi trường Chapman Stone. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.7. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập được
- Nguyên lý chung: Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy.
- Mục đích: Tìm hiểu tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn.
- Tiến hành: Dùng pipet hoặc xi lanh hút 0,1ml canh khuẩn 24h ở môi trường BHI (nồng độ 10-1
) vào ống nghiệm trộn đều với 0,9ml nước muối sinh lý 0,9%; ta được nồng độ 10-2, sau đó ta lại hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 2 ta được nồng độ 10-3 tiếp tục hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 3 ta được nồng độ 10-4. Ống thứ 3 được sử dụng làm kháng sinh đồ.
Hút 0,5ml đã pha loãng nồng độ 10-4, nhỏ toàn bộ dung dịch này lên mặt thạch sau đó dùng que cấy vòng láng đều dung dịch trên môi trường thạch đĩa cho đến khô.
Đặt nhẹ các khoanh giấy kháng sinh chế sẵn lên mặt đĩa thạch. Các khoanh giấy kháng sinh đặt cách nhau 2cm, không quá 6 khoanh giấy kháng sinh trong một đĩa thạch. Sau đó bồi dưỡng ở tủ ấm 370
C/24h. Để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn.
+ Rất mẫn cảm: ф > 20mm
+ Mẫn cảm trung bình: ф từ 15 - 20mm + Mẫn cảm yếu: ф từ 10 - 14mm
+ Kháng thuốc: ф < 10mm
3.4.8. Phương pháp xác định gen sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin) của vi khuẩn Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn
* Phương pháp tách ADN tổng số
- Nguyên lý: Để thu nhận ADN tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein dựa theo nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Nhằm mục đích thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học.
Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.
- Tiến hành:
+ Bơm 1.400 µl mỗi mẫu vào 2 ống Eppendorf rồi ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000v/p trong 7 phút, ở 200C, sau đó thu cặn loại bỏ dịch.
+ Bổ sung 5 µl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37o
C trong 90 phút + Bổ sung 60 µl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn.
+ Bổ sung 600 µl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới.
+ Lặp lại bước trên
+ Kết tủa ADN bằng 350 µl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ. + Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa.
+ Rửa tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu cặn.
- Để khô tự nhiên, sau đó bổ sung 25 µl nước khử ion.
* Phương pháp PCR (Điện di sản phẩm tách ADN tổng số)
- Nguyên lý: Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu.
- Tiến hành:
+ Sau khi đo nồng độ ADN khuôn, tính và tạo các nồng độ ADN của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn được giống nhau, và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.
+ Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng, trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN.
Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng 16,25
Dung dịch đệm (10X) 2,5
dNTPs (10mM) 2,5
Primer P-SEB-F (20pmole/µl ) 1
Primer P-SEB-R (20pmole/µl ) 1
Taq ADN polymerase (2.5u/µl ) 0,25
AND 1,5
Tổng thể tích 25
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
Hình 3.1. Chu trình phản ứng PCR 3.4.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được trong quá trình thực hiện đề tài được chúng tôi xử lý theo phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi của Nguyễn Văn Thiện (2008) [21], ứng dụng chương trình phần mềm Microsoft Excel.
95oC 95oC 5 phút 1 phút 51oC 50 giây 72oC 72oC 1phút 10 phút ∞ 32 chu kì 4oC
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả điều tra hoạt động buôn, bán thịt lợn trên địa bàn một số chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang
Bảng 4.1. Kết quả điều tra hoạt động giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại một số chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang
Chỉ tiêu Địa điểm (chợ) Thời gian hoạt động Số lượng quầy Tỉ lệ quầy đạt tiêu chuẩn kiểm dịch (%) Số lượng lợn giết thịt trung bình (con/ngày/ quầy) Khối lượng thịt lợn tiêu thụ trung bình (kg/ngày) Thái Nguyên Lương Sơn 6-19h 7 100 2 840,7 Sư Phạm 6-20h 12 100 3 2226,8 Nông Lâm 7-19h 7 100 2 835,8 Tuyên Quang Tam Cờ 6-19h 30 100 4 7275,3 Phan Thiết 6-19h 18 100 3 3240,2
Bảng 4.1 cho thấy:
Hoạt động buôn, bán thịt lợn trên địa bàn 3 chợ Nông Lâm, Sư Phạm, Lương Sơn thuộc Thái Nguyên và 2 chợ Tam Cờ và Phan Thiết của Tuyên Quang diễn ra chủ yếu từ 6h - 20h. Số lượng lợn giết thịt được khảo sát dao động từ 2 - 4 con/ngày với tỷ lệ các quầy đạt tiêu chuẩn kiểm dịch là 100%.
Chợ Tam Cờ có số lượng quầy lớn nhất (30 quầy), khối lượng thịt lợn tiêu thụ trung bình là 7275,3kg/ngày.
Đối với 2 chợ Nông Lâm và Lương Sơn khối lượng thịt lợn tiêu thụ trung bình trong khoảng từ 835,8kg/ngày (chợ Nông Lâm) tới 840,7kg/ngày (chợ Lương Sơn).
Chợ Sư Phạm (Thái Nguyên) có số lượng quầy là 12 quầy với khối lượng thịt tiêu thụ trung bình là 2226,8kg/ngày. Trong khi đó chợ Phan Thiết (Tuyên Quang) có khối lượng thịt tiêu thụ trung bình là 3240,2kg/ngày với số lượng quầy là 18 quầy.
Số lượng các quầy bán thịt lợn tươi và khối lượng thịt lợn tiêu thụ tại các chợ có sự chênh lệch đáng kể do qui mô và vị trí địa l í tự nhiên, xã hội, đồng