Để kiểm tra khả năng bền pH của phytase tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành ủ các mẫu enzyme ở 37 °C/ 30 phút trong dải pH 1 (đệm KCl – HCl 0,1M), 2 - 3 (đệm glycine – HCl 0,1M), 4 - 6 (đệm Na-citrate 0,1M), 7 – 9 (đệm Tris – HCl 0,1M), 10 (đệm glycine – NaOH 0,1M), sau đó đƣợc pha loãng trong đệm Na – acetate 50mM pH 5,0 và kiểm tra hoạt tính theo phƣơng pháp Shimizu. Mẫu đối chứng là enzyme pha loãng trong đệm Na – acetate 50mM pH 5,0. Hoạt tính còn lại đƣợc tính theo hoạt tính của mẫu đối chứng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 4 lần. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.13 cho thấy, chủng mang gen phyA cải biến vẫn duy trì đƣợc khả năng bền pH axit. Cả hai chủng đều hoạt động tốt ở pH 3,0 và hoạt tính còn trên 65% ở điều kiện pH 2,0. Kết quả này chỉ ra rằng chủng X33.AAS5.2 đã cải biến của chúng tôi có thể sinh phytase hoạt động đƣợc trong điều kiện pH thấp của dạ dày. Sự khác biệt giữa chủng cải biến và chủng gốc là khoảng bền pH của phytase cải biến từ 3,0 – 6,0 hẹp hơn chủng gốc từ 3,0 – 7,0, ở pH 7,0 chủng cải
K21-Sinh học thực nghiệm 46 Đặng Thị Kim Anh biến giảm hoạt tính mạnh chỉ còn 30% trong khi chủng gốc vẫn giữ đƣợc 95%. Tuy nhiên, sự khác biệt này không đáng kể bởi vì enzyme phytase hoạt động mạnh ở pha tiêu hóa dạ dày có pH thấp để giải phóng phospho và đƣợc hấp thu khi thức ăn chuyển sang pha ruột non có pH kiềm.
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin. Độ bền pH đƣợc thể hiện bằng hoạt tính còn lại khi xử lý ở các pH khác nhau trong 30 phút. X33.P12.7: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen gốc, X33.AAS5.2: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen đã cải biến. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 4 lần lặp lại.