nạp xung điện
Chuẩn bị tế bào:
- Nuôi sơ cấp Pichia pastoris X33: lấy một vòng que cấy tế bào nấm men nuôi trong 10 ml YPD lỏng 200 rpm/ 28 °C qua đêm.
K21-Sinh học thực nghiệm 25 Đặng Thị Kim Anh - Nuôi thứ cấp: 500 µl dịch nuôi sơ cấp đƣợc bổ sung vào 100 ml môi trƣờng
YPD lỏng 200 rpm/ 28 °C qua đêm.
- Dịch nuôi thứ cấp đƣợc ủ trên đá 10 phút. Sinh khối đƣợc thu bằng cách ly tâm 3000 rpm/ 4 °C/ 5 phút, gạn bỏ dịch. Nƣớc cất 2 lần vô trùng, lạnh đƣợc bổ sung vào mỗi ống sinh khối, tế bào đƣợc hòa tan bằng cách lắc nhẹ nhiều lần.
- Ly tâm, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào. Tế bào đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần đã hấp, lạnh. Sau đó tế bào đƣợc rửa bằng Sorbitol 1M lạnh.
- Ly tâm 3000 rpm/ 4°C/ 5 phút, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào. Sorbitol 1M lạnh đƣợc bổ sung vào ống falcon sinh khối, hòa tan tế bào bằng cách lắc nhẹ. Dịch tế bào đƣợc chuyển sang các Eppendorf ủ trên đá cho đến khi biến nạp.
Biến nạp xung điện:
- DNA tinh chế sau khi cắt giới hạn đƣợc bổ sung vào 100 µl dịch tế bào Pichia pastoris, đảo nhẹ để DNA phân bố đều trong dịch tế bào, chuyển dịch này sang Cuvette và ủ trên đá 15 phút.
- Cuvette đƣợc đƣa vào máy Micro Pulser (Biorad) đã cài đặt chế độ biến nạp
Pichia pastoris (2.0 kV, 1 msec) nhấn enter.
- Lập tức bổ sung 1 ml Sorbitol 1M vào Cuvette và chuyển dịch sang ống Falcon 15 ml. Nuôi tĩnh tế bào ở 28 °C trong 1-2 giờ.
- Môi trƣờng YPDS đƣợc bổ sung vào dịch tế bào biến nạp và nuôi lắc 200 rpm/ 28 °C/ 1-2 giờ. Sau đó, tế bào đƣợc cấy chang trên đĩa YPDS (zeocin 100 µg ml-1). Ủ ở 30 °C 3 - 10 ngày. Các tế bào biến nạp thành công sẽ mang gen kháng zeocin có khả năng phát triển tạo khuẩn lạc màu trắng trên đĩa YPDS- zeocin.