Để khẳng định vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 đã đƣợc cài vào hệ gen của Pichia pastoris X33, trên mỗi đĩa thạch nuôi cấy chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc để tách DNA tổng số và PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen T-phyA-EcoRI-F/ phyA-Stop-XbaI-R2. Các khuẩn lạc X33.P12.1, 2, 5, 7; X33.AAS5.1, 2, 3, 6 đƣợc lựa chọn nuôi cấy trên đĩa thạch YPD ở 28 °C trong 2 ngày để thu sinh khối. DNA tổng số đƣợc tách chiết theo quy trình của mục 2.2.7. Sản phẩm DNA thu đƣợc sau đó dùng làm khuôn để PCR với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94 °C: 3 phút, (94 °C: 30 s, 52 °C: 30 s, 70 °C: 1 phút 30 s) ×25, 72°C: 10 phút, 4 °C: ∞. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy, 8 thể biến nạp X33.P12.1, 2, 5, 7; X33.AAS5.1, 2, 3, 6 đều xuất hiện băng DNA có kích thƣớc gần với băng DNA thang chuẩn 1,5 kb (Hình 3.10).
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyA- Stop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×. M: Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-4: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.P12.1, 2,
K21-Sinh học thực nghiệm 41 Đặng Thị Kim Anh 5, 7; 5-8: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.AAS5.1, 2, 3, 6; 9: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.
Kết quả trên đúng nhƣ tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng với gen phyA khoảng 1378 bp. Đối với phản ứng đối chứng âm là sử dụng DNA tổng số của chủng X33 gốc làm khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào. Nhƣ vậy, chúng tôi có thể kết luận là hai gen phyA gốc và phyA cải biến đã đƣợc cài vào genome của Pichia pastoris X33.