Sản phẩm Mega-PCR lần 2 sau khi cắt gel và tinh chế bằng kít GenJETTM Gel Extraction để loại bỏ toàn bộ các thành phần của phản ứng PCR và các băng DNA không đặc hiệu khác và đƣợc dùng làm khuôn để khuếch đại toàn bộ đoạn gen phyA
bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F, T-phyA-XbaI-R2. Đoạn gen phyA thu đƣợc mang 4 đột biến điểm, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn với cặp enzyme
EcoRI-XbaI để tạo trình tự ghép nối ở hai đầu gen. Đồng thời, vector pPICZαA cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme giới hạn trên để tạo vector mở vòng. Các sản phẩm cắt giới hạn đƣợc tinh chế bằng bộ kit GeneJETTM Gel Extraction để làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối.
Lƣợng DNA sau khi tinh chế đƣợc xác định bằng máy đo Nano Drop 2000 (Thermo scientific) ở bƣớc sóng 260nm. Đoạn gen phyA có nồng độ là 32 ng μl-1, vector pPICZαA mở vòng có nồng độ thấp hơn là 16 ng μl-1. Từ kết quả này, chúng tôi tiến hành bổ sung vào phản ứng ghép nối hai đoạn DNA với tỉ lệ số phân tử gen
phyA:pPICZαA là 3:1. Phản ứng ghép nối đƣợc thực hiện bằng enzyme T4 DNA ligase ở 16 °C qua đêm (16 giờ) và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (Hình 3.4-A).
Hình 3.4.Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào vector pPICZαA; A: Thể biến nạp trên đĩa môi trƣờng LB low salt - zeocin 25 μg ml-1; B: M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1: sản phẩm PCR gen phyA
với khuôn là plasmid pPICZαA/phyA/P12 gốc; 2-12: sản phẩm PCR-colony khuẩn lạc số 1-11; 13: sản phẩm PCR với khuôn là H2O.
K21-Sinh học thực nghiệm 35 Đặng Thị Kim Anh Kết quả biến nạp cho thấy số lƣợng các thể biến nạp mang vector pPICZαA tái tổ hợp là rất lớn. Chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 11 thể biến nạp khác nhau để PCR-colony kiểm tra với cặp mồi chéo: α-factor, T-phyA-XbaI-stop-R2. Kết quả điện di trên Hình 3.4-B cho thấy, chúng tôi có thể đã biến nạp đƣợc gen phyA có kích thƣớc khoảng 1,3 kb mang 4 đột biến điểm vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn 5 khuẩn lạc dƣơng tính (ký hiệu là pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5) nuôi trong 10 ml môi trƣờng LB low salt có bổ sung zeocin 25 μg ml-1 lắc 300 rpm ở 37 °C, qua đêm. Lƣợng tế bào sau đó đƣợc thu lại bằng ly tâm 6000 rpm/ 20 °C/ 5 phút và tách plasmid theo kit GenJETTM Plasmid Miniprep của hãng Thermo scientific (Hình 3.5: giếng 3, 6, 9, 12, 15).
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo Scientific); 3, 6, 9, 12, 15: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 ; 1, 4, 7, 10, 13: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 cắt bởi BamHI-BglII; 2, 5, 8, 11, 14: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 cắt bởi XbaI-EcoRI.
Để xác định gen phyA đã đƣợc chèn vào đúng vị trí hay chƣa, chúng tôi tiến hành cắt giới hạn 5 plasmid trên bằng 2 cặp enzyme giới hạn EcoRI-XbaI, BamHI-
BglII. Kết quả điện di cho thấy, đoạn gen phyA đã đƣợc chèn vào đúng vị trí hai enzyme cắt giới hạn EcoRI, XbaI nên sau khi xử lý bằng hai enzyme này tạo hai đoạn DNA 3,6 kb-khung plasmid pPICZαA và đoạn DNA 1,3 kb-gen phyA (Hình 3.5-giếng 2, 5, 8, 11, 14). Đồng thời, sau sau khi xử lý bằng hai enzyme BglII và
BamHI, các vector mang gen đột biến bị cắt tạo một cấu trúc biểu hiện chứa vùng AOX1 promoter, gen PhyA, trình tự kết thúc có kích thƣớc khoảng 3 kb và phần
K21-Sinh học thực nghiệm 36 Đặng Thị Kim Anh còn lại của vector pPICZαA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb (Hình 3.5-giếng 1, 4, 7, 10, 13).
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5.
Để khẳng định gen PhyA đã đƣợc cải biến thông qua bốn đột biến điểm bằng Mega-PCR, 5 plasmid tái tổ hợp pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 đƣợc đọc trình tự bằng cặp mồi của vector pPICZαA là 5‟ α-factor và 3‟ AOX1. Kết quả sau khi đọc đƣợc so sánh với trình tự gen phyA gốc bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 cho thấy 3 trong 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 5 đã tạo đƣợc 4 đột biến điểm nhƣ dự kiến, ngoài ra trên toàn bộ gen không có bất kỳ đột biến không mong muốn nào (Hình 3.6). Cụ thể nhƣ sau: tại vị trí axit amin thứ 58, 65, 191, 217 ban đầu là alanin, proline, glutamine, threonine đƣợc mã hóa bởi bộ ba nucleotide GCA, CCT, CAA, ACC sau khi cải biến bằng Mega-PCR chuyển thành bộ ba nucleotide tƣơng ứng là GAA, TCT, AGA, AGA dẫn đến các axit amin trên bị thay thế bởi glutamic, serine, arginine, arginine (Hình 3.7). Nhƣ vậy, gen phyA-P12 mã hóa phytase đã đƣợc cải biến thành công nhƣ mong muốn của chúng tôi. Hai plasmid pPICZαA/phyA/AAS5 và pPICZαA/phyA/P12 đƣợc tách chiết từ tế bào E. coli để làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33.
K21-Sinh học thực nghiệm 37 Đặng Thị Kim Anh
5’-AOX1 mARN Vị trí bám mồi 5’-AOX1
AACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGAT GGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATT
Mã mở đầu Trình tự đọan peptide tín hiệu bài tiết (-factor) ATTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCA GTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAG GGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTAT
Vị trí bám mồi -factor Kex2 Ste13 Ste1EcoRI
TGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCTGGCG TCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCACTTGCGATACGGTCGATCAGGGGTATCAATGCTTCTCGGAGACTTCGC
A58E P65S
ATCTTTGGGGCCAATACGCGCCGTTCTTTTCTCTGGAAAACAAATCGGCCATCTCCTCTGATGTTCCTGCCGG
ATGCCAAGTCACTTTCGCCCAGGTTCTCTCCCGCCATGGAGCACGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAA
gen phyA từ chủng Aspergillus niger CNTP 5131 đã cải biến 4 axit amin
TACTCCGCTCTCATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCGACAACCTTCGAGGGGAAATATGCCTTCCTGAAGACAT ACAACTACAGCCTGGGCGCGGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAGCAGGAGCTGGTCAACTCCGGCGTCAAGTT CTACCAGCGATACGAATCGCTCACAAGAAACATTGTCCCGTTCATCCGATCCTCAGGCTCCAGCCGCGTGATT Q191R GCCTCTGGCAATAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACTAAGCTGAAAGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCAGAT CGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATTTCAGAGGCCAGCACATCCAACAACACTCTCGATCCGGGCACCTGCAC CGTTTTCGAAGATAGCGAATTGGCCGATGACATCGAAGCCGATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGT CAACGTCTGGAGAACGACCTGTCTGGCGTGTCTCTCACGGACACCGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCT T271R CCTTCGACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGAAGA ATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCCTGAACAAATACTACGGCCATGGCGCAGGTAACCCGCTCGGCCCG ACCCAGGGCGTCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTCACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCAGCT CCAACCACACATTGGACTCCAACCCGGCTACTTTCCCGCTCAACTCCACTCTCTATGCGGACTTCTCGCATGA TAACGGCATCATCTCTATCCTGTTTGCTTTGGGTCTGTACAACGGCACCAAGCCGCTGTCTTCCACGACCGCG GAGAATATCACCCAGACCGATGGGTTCTCATCTGCCTGGACGGTTCCTTTCGCGTCGCGCATGTACGTCGAGA TGATGCAATGCCAGTCTGAGCAGGAGCCTTTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTTCCGCTGCATGG CTGTCCGGTTGATGCTTTGGGGAGATGTACGCGGGATAGCTTCGTGAAGGGTTTGAGCTTTGCCAGATCCGGC Stop1 XbaI c-myc epitope
GGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAATCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTC
His-Tag Stop2
GACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTAC
Vị trí bám mồi 3’-AOX1
GAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCA
Vị trí 3’ của polyA
TTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGA
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và vị trí liên kết trong pPICZA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057. Gen đã đƣợc tạo đột biến điểm làm thay đổi 4 axit amin (A58E, P65S, Q191R, T271R) và sửa đổi mã kết thúc từ TGA thành TAA.
K21-Sinh học thực nghiệm 38 Đặng Thị Kim Anh