Để nghiên cứu đặc tính của enzyme sau khi cải biến gen, hai dòng nấm men X33.AAS5.2 (P. pastoris CNTP 9057) và X33.P12.7 (P. pastoris CNTP 9056) đƣợc lựa chọn nuôi biểu hiện trên môi trƣờng biểu hiện BMM với quy mô bình tam giác 1 lít. Sau 96 giờ biểu hiện, dịch enzyme thô đƣợc thu hồi bằng cách ly tâm 8000 rpm/ 4 °C/ 15 phút để loại bỏ sinh khối. Dịch enzyme thô ban đầu vẫn còn chứa rất nhiều thành phần không mong muốn nhƣ: muối khoáng, đệm phosphate, methanol dƣ thừa, các phân tử hữu cơ nhỏ ... Vì vậy, để không ảnh hƣởng tới kết quả của thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi cần phải cô đặc và loại bỏ các thành phần này bằng cách lọc luân hồi qua hệ thống Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa, quy trình đƣợc thực hiện theo mục 2.2.11.
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa.
Mẫu Giai đoạn
Thể tích (ml) Hoạt tính phytase (IU ml-1) Hoạt tính phytase tổng (IU ml-1) Hiệu suất thu hồi (%) X33.AAS5.2 Cross Flow 30 391,87 11756,1 95,11 Dịch gốc 232 53,28 12361,0 Dịch thải 700 0,62 434 X33.P12.7 Cross Flow 25 502,46 12561,5 93,18 Dịch gốc 256 52,66 13481,0 Dịch thải 725 0,7 507,5
Sau khi lọc Cross Flow, dịch enzyme gốc đƣợc cô lại 7-10 lần và đƣợc bảo quản trong đệm Na-acetate 50mM pH 5,0. Kết quả sau khi cô cho thấy, hoạt tính enzyme thu hồi đạt 93 – 95 % (Bảng 3.2). Nhƣ vậy, quá trình thu nhận enzyme
K21-Sinh học thực nghiệm 43 Đặng Thị Kim Anh bằng màng lọc 5 kDa có hiệu suất thu hồi cao. Dịch enzyme cô có thành phần protein khá đơn giản bao gồm protein ngoại bào của nấm men Pichia pastoris X33 và một băng đậm nét có kích thƣớc gần với bằng protien chuẩn 66 kDa (giếng A, P - Hình 3.11). Với mong muốn enzyme tái tổ hợp có độ sạch cao phục vụ nghiên cứu đặc tính của phytase từ hai dòng nấm men X33.AAS5.2, X33.P12.7 chúng tôi tiến hành tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Phụ lục 2 - Hình P1, P2).
Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12%. M: Unstained protein molecular weight marker (Thermo scientific); A: Dịch enzyme từ chủng mang gen phyA cải biến X33.AAS5.2 sau khi cô Cross Flow; A15, 24: phân đoạn 15, 24 của phytase đã cải biến sau khi chạy sắc ký kỵ nƣớc cột Butyl Sepharose HP, 10 ml; P: Dịch enzyme từ chủng mang gen phyA gốc X33.P12.7 sau khi cô Cross Flow; P45, 50, 58, 81: phân đoạn 45, 50, 58, 81 của phytase gốc sau khi chạy sắc ký kỵ nƣớc cột Butyl Sepharose HP, 10 ml.
Kết quả điện di SDS-PAGE trên Hình 3.11 cho thấy dịch enzyme sau khi tinh chế chỉ thu đƣợc một băng protein duy nhất có kích thƣớc khoảng 66 kDa ở các phân đoạn P45 - 81 của chủng X33.P12.7, phân đoạn A15 - 24 của chủng X33.AAS5.2. Trong đó, A15 và P45 là hai phân đoạn chứa đỉnh peak protein thể hiện hoạt tính phytase cao nhất (Phụ lục 2- Hình P1, P2). Kết quả này chứng minh rằng băng protein có kích thƣớc khoảng 66 kDa chính là phytase tái tổ hợp mà chúng tôi mong muốn. Tuy nhiên, theo tính toán lý thuyết, phytase tái tổ hợp có
K21-Sinh học thực nghiệm 44 Đặng Thị Kim Anh kích thƣớc khoảng 45 kDa. Sự sai khác này có thể do quá trình biến đổi sau dịch mã ở nấm men P. pastoris, phân tử phytase sau khi tổng hợp sẽ đƣợc glycosyl hóa ở mạng lƣới nội chất và trong hệ thống Golgi. Các oligosarcharide đƣợc gắn vào vị trí N và O của phân tử protein sau đó đƣợc biến đổi trở thành protein có hoạt tính và tiết ra môi trƣờng bên ngoài. Quá trình này làm cho kích thƣớc phân tử của phytase tăng lên đáng kể. Kết quả này tƣơng tự nhƣ phytase tái tổ hợp từ A. niger NRRL 3135 trên P. pastoris, gen mã hóa cho enzyme này có kích thƣớc khoảng 1,4 kb và phân tử protein khoảng 80 kDa với 10 vị trí glycosyl hóa [69].