Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc là một trong những phƣơng pháp hữu ích để tinh sạch protein hiện nay. Nguyên lý của phƣơng pháp này dựa trên tƣơng tác kỵ nƣớc giữa protein và nhóm kỵ nƣớc đƣợc gắn trên chất nền của pha tĩnh thƣờng là các gốc alkyl từ 2-8 carbon. Trong điều kiện muối cao, (NH4)2SO4 2 - 2,5M, các phân tử protein chứa các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng liên kết lại với nhau. Khi đƣợc đƣa vào cột, tƣơng tác kỵ nƣớc của các hạt gel mạnh hơn dẫn đến các phân tử protein bị bắt giữ tạo thành cấu trúc đƣợc bao bọc bởi các nhóm ƣa nƣớc bên ngoài. Các chất bẩn không tƣơng tác với gel đƣợc loại bỏ khi rửa cột. Quá trình rửa giải đƣợc thực hiện bằng cách giảm nồng độ muối (NH4)2SO4 cho đến khi protein mong muốn đƣợc hòa tan trong dung dịch và ra khỏi cột.
K21-Sinh học thực nghiệm 30 Đặng Thị Kim Anh
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cải biến trình tự gen mã hóa phytase
3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt
Giới hạn về khả năng chịu nhiệt, chịu axit đang là khó khăn lớn khi ứng dụng enzyme phytase trong chăn nuôi. Vậy nên, khi nghiên cứu đặc tính của enzyme phytase, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến khả năng bền nhiệt và khả năng hoạt động ở điều kiện pH thấp. Việc phân tích một số vị trí axit amin của các chủng đã nghiên cứu và so sánh với các công bố trƣớc đó cũng rất có ý nghĩa đến việc dự đoán đƣợc đặc tính enzyme. Trong những năm trƣớc, nhóm nghiên cứu Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tách dòng 12 gen mã hóa phytase từ các chủng thuộc chi Aspergillus
sinh phytase ngoại bào bền nhiệt, trong đó có 10 trình tự gen A. niger và 2 trình tự của A. tubingensis có họ hàng gần với A. niger. Trình tự axit main suy đoán của protein trƣởng thành từ các chủng này đƣợc so sánh với trình tự phyA của chủng A. niger NRRL 3135 (GenBank: Z16414) (Hình 3.1). Cấu trúc bậc một của phytase hoàn chỉnh có 467 a.a, bao gồm 19 axit min thuộc đoạn peptide tín hiệu và 448 axit amin thuộc đoạn protein trƣởng thành, tƣơng tự nhƣ phytase từ A. niger NRRL 3135. Điểm đáng chú ý là tất cả 12 gen khảo sát đều có vị trí axit amin bảo thủ A58, P65, Q191, T271 có liên quan đến đặc tính bền nhiệt của enzyme (Phụ lục 1). Nhƣ vậy chúng tôi dự đoán khả năng bền nhiệt của các enzyme phytase tái tổ hợp từ các chủng trên sẽ không cao.
Trong số các chủng nấm mốc đã tách dòng, phytase từ A. niger CNTP 5131 (P12) có độ bền nhiệt cao hơn so với các chủng A. niger khác mà nhóm nghiên cứu sàng lọc đƣợc. Nhƣ vậy, gen mã hóa phytase của chủng này có thể có tiềm năng tạo đƣợc enzyme tái tổ hợp bền nhiệt. Trên thực tế, enzyme này có thể đáp ứng yêu cầu hiện nay về độ bền nhiệt trong quá trình ép viên sản xuất thức ăn gia súc. Tuy nhiên, độ bền nhiệt cao hơn nữa sẽ giúp giảm giá thành sản xuất enzyme khi có thể thay thế công nghệ sấy ở nhiệt độ thấp bằng các phƣơng pháp sấy thông thƣờng.
K21-Sinh học thực nghiệm 31 Đặng Thị Kim Anh
3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi cải biến trình tự gen của nấm mốc A. niger
CNTP 5131 (P12) nhằm nâng cao tính bền nhiệt của phytase tái tổ hợp. Cơ sở để thực hiện việc tạo đột biến xuất phát từ một nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007), 4 axit amin của A. fumigatus sẽ đƣợc thay thế vào vị trí tƣơng ứng của A. niger (A58E, P65S, Q191R, T271R) có thể tăng độ bền nhiệt của phytase nhƣng đồng thời không ảnh hƣởng đến đặc tính pH [73].
Hình 3.1. Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA. Để thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng vector pPICZαA/phyA/P12 mang gen mã hóa phytase tƣơng đối bền nhiệt của A. niger CNTP 5131 làm gen gốc. Các vị trí mã hóa axit amin số 58, 65, 191, 271 sẽ đƣợc thay thế bằng Glutamic axit (E58), Serine (S65), Arginine (R191), Arginine (R271) bằng phƣơng pháp đột biến điểm Mega-PCR. Các mồi PCR đƣợc thiết kế phù hợp với trình tự gen phytase CNTP 5131-P12 (PhyA) và mang đột biến mong muốn. Sơ đồ thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ Hình 3.1.
K21-Sinh học thực nghiệm 32 Đặng Thị Kim Anh Bƣớc đầu tiên, chúng tôi tiến hành tạo hai mồi kích thƣớc lớn: Mega-A58E5 và Mega-T271R bằng phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi phyA-EcoRI-F, A58E5- R và T271R-F, phyA-XbaI-R2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau: 95ºC: 5 phút; (95 ºC: 30 s, 52 ºC: 20 s, 72 ºC: 50 s) × 25; 72 ºC: 10 phút, 4 ºC: ∞. Kết quả điện di cho thấy, chúng tôi đã khuếch đại đƣợc hai đoạn gen mang hai đột biến điểm A58E5 (Mega-1 ~170 bp, Hình 3.2-A, giếng 1) và T271R (Meg-4 ~ 545 bp, Hình 3.2-A, giếng 2).
A B M
Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-A: sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi: phyA-EcoRI-F, A58E5-R; 2-A: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi: T271R-F, phyA-XbaI-R2; 1-B: sản phẩm Mega-PCR cặp mồi A58E5, T271R.
Hai đoạn DNA này đƣợc cắt chính xác và tinh chế bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Thermo scientific) theo quy trình đã mô tả trong phần 2.2.2 nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch thu đƣợc dùng để làm mồi Mega trong phản ứng Mega-PCR lần 1 tạo đoạn gen phyA
mang hai đột biến thay thế axit amin A58 và T271 ở hai đầu gen. Vì kích thƣớc của cặp mồi Mega là khá lớn nên nhiệt độ gắn mồi theo lý thuyết của chúng là rất cao. Do vậy, chúng tôi đã đƣa nhiệt độ gắn mồi lên bằng nhiệt độ kéo dài chuỗi và phản ứng trong vòng 2,5 phút mỗi chu kỳ. Kết quả trên hình 3.2-B cho thấy, sản phẩm
K21-Sinh học thực nghiệm 33 Đặng Thị Kim Anh Mega-PCR còn chứa nhiều khuôn và mồi Mega, đoạn gen đích có kích thƣớc khoảng 1,3 kb (giếng 1). Vì vậy chúng tôi tiến hành cắt gel và tinh chế đoạn DNA 1,3 kb để làm khuôn cho phản ứng Mega-PCR tiếp theo.
Sản phầm DNA mang hai đột biến sau tinh chế đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR tạo hai mồi Mega tiếp theo. Hai cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm này mang 4 đột biến điểm là: (phyA-EcoRI-F, P65S-R) và (Q191R-F, phyA-XbaI-R2). Sau phản ứng PCR, đoạn DNA P65S (Mega-primer 2 ~195 bp, Hình 3.3-A, giếng 1) chứa hai đột biến điểm ở vị trí 170 và 195 trong gen phyA và đoạn DNA Q191R (Mega-primer 3 ~ 785 bp, Hình 3.3-A, giếng 2) chứa hai đột biến điểm ở vị trí 573 và 813 trong gen phyA.
A B M
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-A: P65S Mega-primer sau tinh chế; 2-A: Q195R Mega-primer sau tinh chế; 1-B: Sản phẩm Mega-PCR lần 2.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh chế, sau đó dùng làm mồi Mega cho phản ứng Mega-PCR lần hai để khuếch đại toàn bộ đoạn gen phyA chứa 4 điểm đột biến. Chu trình nhiệt của phản ứng Mega- PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau: 95 ºC: 5 phút; (95 ºC: 30 s, 72 ºC: 3 phút) × 25; 72 ºC: 10 phút, 4 ºC: ∞. Kết quả điện di Hình 3.3-B cho thấy, chúng tôi đã khuếch đại đƣợc đoạn gen phyA kích thƣớc khoảng 1.3 kb tƣơng ứng nhƣ lý thuyết bằng phản ứng PCR với cặp mồi Mega chứa 4 đột biến điểm.
K21-Sinh học thực nghiệm 34 Đặng Thị Kim Anh
3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm
Sản phẩm Mega-PCR lần 2 sau khi cắt gel và tinh chế bằng kít GenJETTM Gel Extraction để loại bỏ toàn bộ các thành phần của phản ứng PCR và các băng DNA không đặc hiệu khác và đƣợc dùng làm khuôn để khuếch đại toàn bộ đoạn gen phyA
bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F, T-phyA-XbaI-R2. Đoạn gen phyA thu đƣợc mang 4 đột biến điểm, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn với cặp enzyme
EcoRI-XbaI để tạo trình tự ghép nối ở hai đầu gen. Đồng thời, vector pPICZαA cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme giới hạn trên để tạo vector mở vòng. Các sản phẩm cắt giới hạn đƣợc tinh chế bằng bộ kit GeneJETTM Gel Extraction để làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối.
Lƣợng DNA sau khi tinh chế đƣợc xác định bằng máy đo Nano Drop 2000 (Thermo scientific) ở bƣớc sóng 260nm. Đoạn gen phyA có nồng độ là 32 ng μl-1, vector pPICZαA mở vòng có nồng độ thấp hơn là 16 ng μl-1. Từ kết quả này, chúng tôi tiến hành bổ sung vào phản ứng ghép nối hai đoạn DNA với tỉ lệ số phân tử gen
phyA:pPICZαA là 3:1. Phản ứng ghép nối đƣợc thực hiện bằng enzyme T4 DNA ligase ở 16 °C qua đêm (16 giờ) và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (Hình 3.4-A).
Hình 3.4.Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào vector pPICZαA; A: Thể biến nạp trên đĩa môi trƣờng LB low salt - zeocin 25 μg ml-1; B: M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1: sản phẩm PCR gen phyA
với khuôn là plasmid pPICZαA/phyA/P12 gốc; 2-12: sản phẩm PCR-colony khuẩn lạc số 1-11; 13: sản phẩm PCR với khuôn là H2O. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
K21-Sinh học thực nghiệm 35 Đặng Thị Kim Anh Kết quả biến nạp cho thấy số lƣợng các thể biến nạp mang vector pPICZαA tái tổ hợp là rất lớn. Chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 11 thể biến nạp khác nhau để PCR-colony kiểm tra với cặp mồi chéo: α-factor, T-phyA-XbaI-stop-R2. Kết quả điện di trên Hình 3.4-B cho thấy, chúng tôi có thể đã biến nạp đƣợc gen phyA có kích thƣớc khoảng 1,3 kb mang 4 đột biến điểm vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn 5 khuẩn lạc dƣơng tính (ký hiệu là pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5) nuôi trong 10 ml môi trƣờng LB low salt có bổ sung zeocin 25 μg ml-1 lắc 300 rpm ở 37 °C, qua đêm. Lƣợng tế bào sau đó đƣợc thu lại bằng ly tâm 6000 rpm/ 20 °C/ 5 phút và tách plasmid theo kit GenJETTM Plasmid Miniprep của hãng Thermo scientific (Hình 3.5: giếng 3, 6, 9, 12, 15).
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo Scientific); 3, 6, 9, 12, 15: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 ; 1, 4, 7, 10, 13: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 cắt bởi BamHI-BglII; 2, 5, 8, 11, 14: plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 cắt bởi XbaI-EcoRI.
Để xác định gen phyA đã đƣợc chèn vào đúng vị trí hay chƣa, chúng tôi tiến hành cắt giới hạn 5 plasmid trên bằng 2 cặp enzyme giới hạn EcoRI-XbaI, BamHI-
BglII. Kết quả điện di cho thấy, đoạn gen phyA đã đƣợc chèn vào đúng vị trí hai enzyme cắt giới hạn EcoRI, XbaI nên sau khi xử lý bằng hai enzyme này tạo hai đoạn DNA 3,6 kb-khung plasmid pPICZαA và đoạn DNA 1,3 kb-gen phyA (Hình 3.5-giếng 2, 5, 8, 11, 14). Đồng thời, sau sau khi xử lý bằng hai enzyme BglII và
BamHI, các vector mang gen đột biến bị cắt tạo một cấu trúc biểu hiện chứa vùng AOX1 promoter, gen PhyA, trình tự kết thúc có kích thƣớc khoảng 3 kb và phần
K21-Sinh học thực nghiệm 36 Đặng Thị Kim Anh còn lại của vector pPICZαA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb (Hình 3.5-giếng 1, 4, 7, 10, 13).
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5.
Để khẳng định gen PhyA đã đƣợc cải biến thông qua bốn đột biến điểm bằng Mega-PCR, 5 plasmid tái tổ hợp pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 3, 4, 5 đƣợc đọc trình tự bằng cặp mồi của vector pPICZαA là 5‟ α-factor và 3‟ AOX1. Kết quả sau khi đọc đƣợc so sánh với trình tự gen phyA gốc bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 cho thấy 3 trong 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1, 2, 5 đã tạo đƣợc 4 đột biến điểm nhƣ dự kiến, ngoài ra trên toàn bộ gen không có bất kỳ đột biến không mong muốn nào (Hình 3.6). Cụ thể nhƣ sau: tại vị trí axit amin thứ 58, 65, 191, 217 ban đầu là alanin, proline, glutamine, threonine đƣợc mã hóa bởi bộ ba nucleotide GCA, CCT, CAA, ACC sau khi cải biến bằng Mega-PCR chuyển thành bộ ba nucleotide tƣơng ứng là GAA, TCT, AGA, AGA dẫn đến các axit amin trên bị thay thế bởi glutamic, serine, arginine, arginine (Hình 3.7). Nhƣ vậy, gen phyA-P12 mã hóa phytase đã đƣợc cải biến thành công nhƣ mong muốn của chúng tôi. Hai plasmid pPICZαA/phyA/AAS5 và pPICZαA/phyA/P12 đƣợc tách chiết từ tế bào E. coli để làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33.
K21-Sinh học thực nghiệm 37 Đặng Thị Kim Anh
5’-AOX1 mARN Vị trí bám mồi 5’-AOX1
AACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGAT GGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATT
Mã mở đầu Trình tự đọan peptide tín hiệu bài tiết (-factor) ATTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCA GTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAG GGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTAT
Vị trí bám mồi -factor Kex2 Ste13 Ste1EcoRI
TGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCTGGCG TCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCACTTGCGATACGGTCGATCAGGGGTATCAATGCTTCTCGGAGACTTCGC
A58E P65S
ATCTTTGGGGCCAATACGCGCCGTTCTTTTCTCTGGAAAACAAATCGGCCATCTCCTCTGATGTTCCTGCCGG
ATGCCAAGTCACTTTCGCCCAGGTTCTCTCCCGCCATGGAGCACGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAA
gen phyA từ chủng Aspergillus niger CNTP 5131 đã cải biến 4 axit amin
TACTCCGCTCTCATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCGACAACCTTCGAGGGGAAATATGCCTTCCTGAAGACAT ACAACTACAGCCTGGGCGCGGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAGCAGGAGCTGGTCAACTCCGGCGTCAAGTT CTACCAGCGATACGAATCGCTCACAAGAAACATTGTCCCGTTCATCCGATCCTCAGGCTCCAGCCGCGTGATT Q191R GCCTCTGGCAATAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACTAAGCTGAAAGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCAGAT CGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATTTCAGAGGCCAGCACATCCAACAACACTCTCGATCCGGGCACCTGCAC CGTTTTCGAAGATAGCGAATTGGCCGATGACATCGAAGCCGATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGT CAACGTCTGGAGAACGACCTGTCTGGCGTGTCTCTCACGGACACCGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCT T271R CCTTCGACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGAAGA ATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCCTGAACAAATACTACGGCCATGGCGCAGGTAACCCGCTCGGCCCG ACCCAGGGCGTCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTCACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCAGCT CCAACCACACATTGGACTCCAACCCGGCTACTTTCCCGCTCAACTCCACTCTCTATGCGGACTTCTCGCATGA TAACGGCATCATCTCTATCCTGTTTGCTTTGGGTCTGTACAACGGCACCAAGCCGCTGTCTTCCACGACCGCG GAGAATATCACCCAGACCGATGGGTTCTCATCTGCCTGGACGGTTCCTTTCGCGTCGCGCATGTACGTCGAGA TGATGCAATGCCAGTCTGAGCAGGAGCCTTTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTTCCGCTGCATGG CTGTCCGGTTGATGCTTTGGGGAGATGTACGCGGGATAGCTTCGTGAAGGGTTTGAGCTTTGCCAGATCCGGC Stop1 XbaI c-myc epitope
GGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAATCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTC
His-Tag Stop2
GACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTAC
Vị trí bám mồi 3’-AOX1
GAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCA
Vị trí 3’ của polyA
TTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGA
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và vị trí liên kết trong pPICZA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057. Gen đã đƣợc tạo đột biến điểm làm thay đổi 4 axit amin (A58E, P65S, Q191R, T271R) và sửa đổi mã kết thúc từ TGA thành TAA.
K21-Sinh học thực nghiệm 38 Đặng Thị Kim Anh
3.2. Chuyển gen PhyA vào tế bào nấm men Pichia pastoris
Hiện nay, tế bào nấm men đƣợc coi là giải pháp tốt nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp của tế bào nhân thực trên quy mô sản xuất lớn. Trong đó, Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện đƣợc sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu enzyme tái tổ hợp hiện nay do chúng có nhiều ƣu điểm nhƣ: là tế bào nhân thực thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và cuộn gập cũng nhƣ các biến đổi sau dịch mã, đây là điều kiện cần thiết để đảm bảo enzyme có hoạt tính; thao tác di truyền thực hiện đơn giản, dễ dàng điều khiển sự biểu hiện, gen ngoại lai đƣợc gài vào genome vật chủ nên biểu hiện có độ ổn định cao; thành phần nuôi cấy đơn giản, chi phí lên men thấp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để biết gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger sau khi cải biến có cải thiện khả năng hồi tính của enzyme này sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao đồng thời vẫn duy trì đƣợc khả năng bền pH nhƣ gen gốc hay không, chúng tôi cần phải tiến hành chuyển hai gen này vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33 để biểu hiện và xác định hoạt tính enzyme phytase tái tổ hợp. Vector biểu hiện pPICZαA/phyA/P12, pPICZαA/phyA/AAS5 đƣợc gài vào hệ gen của Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp biến nạp xung điện, tạo ra thể biến nạp X33.P12 và X33.AAS5 mang gen chỉ thị có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa kháng sinh zeocin, chủng P. pastoris X33 không có gen kháng zeocin nên không thể phát triển trên môi trƣờng này. Để kiểm tra gen mã hóa phytase đã đƣợc gài vào genome của các thể biến nạp hay chƣa, chúng tôi sàng lọc bằng cách nuôi biểu hiện trên vi đĩa và phân tích hoạt tính phytase, sau đó tách chiết DNA tổng số của các thể biến nạp sinh phytase cao để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen.
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện xung điện
Kỹ thuật biến nạp bằng xung điện đƣợc lựa chọn do ƣu thế về hiệu suất biến nạp cao và hóa chất, thao tác thí nghiệm đơn giản. Dƣới tác dụng của điện trƣờng