Mega-PCR là kĩ thuật cải biến trình tự gen thông qua việc tạo những biến đổi chủ đích sử dụng PCR. Phƣơng pháp cơ bản của kĩ thuật Mega-PCR cần 3 mồi oligonucleotide và hai bƣớc PCR sử dụng khuôn là gen gốc (Hình 2.2). Mồi đột biến đƣợc kí hiệu là M và hai mồi ngoài là R, F. Mồi M có thể thiết kế để thay thế, xóa bỏ, chèn, hoặc tổ hợp các đột biến này, vì vậy, kĩ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Bƣớc PCR đầu tiên sử dụng mồi M và mồi F để tạo ra mồi Mega có kích thƣớc khá lớn. Đoạn DNA đƣợc tạo thành từ hai mồi F, M đƣợc tinh chế và đóng vai trò là mồi trong bƣớc PCR thứ hai cùng với mồi R. Sản phẩm PCR lần thứ hai chính là đoạn DNA gốc đã đƣợc cải biến bên trong nhờ mồi M.
K21-Sinh học thực nghiệm 22 Đặng Thị Kim Anh
Hình 2.2.Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản.
Sản phẩm Mega-PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×. Mẫu gồm 5 l sản phẩm PCR đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol blue, xylene cyanol và nạp vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt cm-1 gel, sau 25 phút, gel đƣợc lấy ra và nhuộm trong dung dịch chứa ethidium bromide (EtBr) trong 10 phút. Gel agarose đƣợc vớt ra và rửa bằng nƣớc để loại bỏ EtBr bám không đặc hiệu. Các băng DNA đƣợc quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng UV bằng máy soi gel SynGene.