: Kỹ thuật ELISA, hóa phát quang (CLIA), điện hóa phát quang (ECLIA) * Nguyên lý kỹ thuật chung đƣợc sử
2.3.2.1. Các kỹ thuật miễn dịch đánh dấu dụng trong các xét nghiệm:
- Kỹ thuật Sandwich [78], ví dụ các sinh phẩm dùng để phát hiện HBsAg trong mẫu thử (thực hiện bằng kỹ thuật ELISA, hóa phát quang, điện hóa phát quang).
+ Kháng thể kháng chống virus có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN vi rú t đã đƣợc cố định trên giá đỡ . Phức hợp KN-KT sẽ đƣợc phát hiện bởi cộng hợp là các KN vi rút gắn các chất đánh dấu (men, chất hóa phát quang) khi cho phản ứng hiện màu với cơ chất hoặc phát ra ánh sáng.
Formatted: Normal, Justified, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
+ Giá trị mật độ quang (OD: optical density) của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lƣợng KT kháng virus hiện diện trong mẫu thử.
Kỹ thuật gián tiếp [78]: ví dụ các sinh phẩm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu : Abbott Architect anti- HCV (xét nghiệm trên hệ thống Architect), Roche Elecssys Anti HCV (trên hệ thống Roche Cobas 8000):
- Kháng thể kháng virus có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN vi rút đã đƣợc cố định sẵn trên giá đỡ. Phức hợp KN-KT này đƣợc phát hiện bởi một cộng hợp là một KT kháng globuline ngƣời (Ig) có gắn chất đánh dấu và sẽ cho phản ứng hiện màu/phát quang với một cơ chất thích hợp.
- Giá trị mật độ quang của phản ứng màu/phát quang tỷ lệ thuận với lƣợng kháng thể kháng virus hiện diện trong mẫu thử.
Kỹ thuật phát hiện đồng thời KN và KT [78], ví dụ các sinh phẩm Biorad Genscreen Ultra HIV Ag-Ab, Biorad Monolisa HCV Ag-Ab Ultra (xét nghiệm đƣợc thực hiện trên hệ thống máy EVOLIS, ELITE), Abbott Architech HIV Ag/Ab Combination (xét nghiệm trên hệ thống máy Abbott Architect i2000), Roche Elecsys HIV COMBI PT (xét nghiệm trên hệ thống máy Roche Cobas 8000) đều có khả năng phát hiện kháng nguyên và kháng thể chống virus có trong mẫu thử).
+ Các sinh phẩm này dùng kỹ thuật phát hiện đồng thời KN virus viêm (virus virus viêm gan C và HIV) cho phép phát hiện sớm nhiễm HCV/HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh. KN virus và KT kháng lại virus hiện diện trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN virus hoặc KT, phức hợp KN-KT sẽ đƣợc phát hiện bởi các cộng hợp gắn chất đánh dấu cho phản ứng hiện màu/phát quang sau khi cho cơ chất.
Nhận định và đánh giá kết quả [78]:
Nhận định và đánh giá kết quả theo quy trình chuẩn đã đƣợc Viện HH-TMTW phê duyệt trên cơ sở áp dụng hƣớng dẫn của nhà sản xuất trong việc thực hiện kiểm tra chất lƣợng và đánh giá kết quả xét nghiệm.
Trả kết quả cho đơn vị máu hiến đƣợc thực hiện theo sơ đồ chiến lƣợc I (áp dụng cho an toàn truyền máu): Mẫu đƣợc coi là dƣơng tính khi mẫu đó phản ứng với một xét nghiệm bằng sinh phẩm có độ nhạy cao. Trong an toàn truyền máu, cấy ghép
Formatted: List Paragraph, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.3 li, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0 cm + Indent at: 0.63 cm
Formatted: List Paragraph, Indent: Left: 0.63 cm, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
mô tạng, thụ tinh nhân tạo thì những đơn vị máu và sản phẩm máu hoặc mô, bộ phận cơ thể phải loại bỏ nếu có kết quả xét nghiệm dƣơng tính [40], [78].
2.3.2.2. Kỹ thuật NAT *Nguyên lý kỹ thuật NAT
Các phƣơng pháp xét nghiệm NAT theo nguyên lý TMA hoặc Real time PCR đang thực hiện tại Viện HHTMTW gồm 3 bƣớc thực hiện:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu (gồm các bƣớc tập trung virus và tách chiết axit nucleic của virus);
- Bƣớc 2: Khuếch đại DNA/RNA đích bằng nguyên lý TMA hoặc Realtime PCR - Bƣớc 3: Phát hiện sản phẩm đƣợc khuếch đại.
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp Realtime PCR [36]: Tính toán dựa trên giá trị ngƣỡng của phản ứng.
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp TMA
Các photon đƣợc đo bởi máy đo tín hiệu phát quang và đƣợc thông báo bằng đơn vị RLU (relative light units). Bất kỳ mẫu nào có tín hiệu “glower” trên giá trị cut- off là có phản ứng với HIV-RNA và/hoặc HBV-DNA và/hoặc HCV-RNA. Những mẫu này phải đƣợc xác định là phản ứng với loại virus nào bằng cách sử dụng những mồi đặc hiệu riêng cho loại virus đó trong kít chạy phân biệt Ultrio HBV, HCV, HIV [73].
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Hình 2.12. Đƣờng cong khuếch đại sản phẩm sau real time PCR [36]
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp TMA
Các photon đƣợc đo bởi máy đo tín hiệu phát quang và đƣợc thông báo bằng đơn vị RLU (relative light units). Bất kỳ mẫu nào có tín hiệu “glower” trên giá trị cut-off là có phản ứng với HIV-RNA và/hoặc HBV-DNA và/hoặc HCV-RNA. Những mẫu này phải đƣợc xác định là phản ứng với loại virus nào bằng cách sử dụng những mồi đặc hiệu
riêng cho loại virus đó trong kít chạy phân biệt Ultrio HBV, HCV, HIV [73].