CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG SÀNG LỌC HBV, HCV, H- 123docz.net

1.2.1. Các kỹ thuật sàng lọc kháng nguyên HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV

Để phát hiện sự có mặt của virus, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp tìm kháng nguyên của virus hoặc kháng thể chống virus trong huyết thanh. Có 3 loại kỹ thuật chính hiện đang đƣợc sử dụng là [81]:

• Kỹ thuật ngƣng kết hạt vi lƣợng (PA); • Kỹ thuật nhanh (Quick test);

• Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu: Kỹ thuật ELISA, kỹ thuật miễn dịch hóa phát quang (CLIA), kỹ thuật điện hóa phát quang (ECLIA)

•

1.2.1.1. Kỹ thuật ngƣng kết hạt vi lƣợng (PA – Particular agglutination) Nguyên lý kỹ thuật:

Các hạt gelatin hoặc latex đƣợc gắn với các thành phần kháng nguyên của virus hoặc kháng thể chống virus và sẽ cho phản ứng ngƣng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với virus hoặc kháng nguyên của virus có mặt trong mẫu thử [37].

Formatted: Indent: Left: 0.63 cm, Hanging: 0.63 cm, Outline numbered + Level: 1 + Numbering Style: Bullet + Aligned at: 0 cm + Indent at: 0 cm

Có 2 loại kỹ thuật ngƣng kết hạt vi lƣợng chủ yếu đƣợc thực hiện là:

- Kỹ thuật phát hiện kháng thể: Các hạt gelatin hoặc latex đƣợc gắn với các thành

phần kháng nguyên của virus và sẽ cho phản ứng ngƣng kết đặc hiệu với kháng thể chống virus có mặt trong mẫu thử [37].

- Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên: : Các hạt gelatin hoặc latex đƣợc gắn với các các kháng thể chống lại các kháng nguyên của virus và cho phản ứng ngƣng kết đặc hiệu với kháng nguyên của virus có mặt trong mẫu thử [37].

1.2.1.2. Các xét nghiệm nhanh

Đặc điểm chung của các thử nghiệm nhanh là nhanh, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi máy móc chuyên biệt. Các thử nghiệm nhanh cho kết quả trong một thời gian tƣơng đối ngắn và đọc bằng mắt thƣờng. Một số xét nghiệm nhanh có độ nhạy kém hơn so với kỹ thuật ELISA khi sử dụng để phát hiện các mẫu máu của ngƣời đã bị nhiễm trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh trên các mẫu máu trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [37].

1.2.1.3. Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu: Kỹ thuật ELISA/ kỹ thuật hóa phát quang (CLIA)/điện hóa phát quang (ECLIA)

ELISA là một xét nghiệm sàng lọc thƣờng đƣợc thực hiện tại các ngân hàng máu để sàng lọc cho ngƣời hiến máu, kỹ thuật này đƣợc thực hiện trên các hệ thống máy tự động, thích nghi với số lƣợng lớn các mẫu, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí hiệu quả. Cho đến nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc bốn thế hệ kít ELISA, sử dụng để sàng lọc máu ngƣời cho:

Thế hệ ELISA đầu tiên: Sử dụng kháng nguyên của virus đƣợc tìm thấy ở trong tế bào lympho ngƣời, mẫu virus phân lập đƣợc thƣờng chứa một lƣợng nhỏ các thành phần tế bào vật chủ, do đó hay gây nên tình trạng dƣơng tính giả [7], [59].

Các công nghệ ELISA đã đƣợc cải thiện và thế hệ kít ELISA thứ hai thƣờng có nguồn gốc nhân tạo, kháng nguyên tái tổ hợp đƣợc phân lập từ vi khuẩn hoặc nấm [7].

Thế hệ kít thứ ba: Sử dụng các oligopeptit khoảng 15-40 axit amin (peptide tổng hợp) [7].

Thế hệ thứ tƣ: là sản phẩm đƣợc thiết kế và sản xuất dựa trên sự kết hợp của các peptide tái tổ hợp và sợi nhân tạo để có thể phát hiện đồng thời cả kháng nguyên HIV (kháng nguyên p24) và kháng thể. Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trƣớc khi có sự chuyển đổi huyết thanh và là sinh phẩm đƣợc khuyến cáo nên lựa chọn sử dụng để sàng lọc HIV cho ngƣời hiến máu [7], [59].

Trên cơ sở các nguyên tắc của các thử nghiệm ELISA có thể đƣợc chia thành: gián tiếp, cạnh tranh, sandwich (Kẹp chả). Tuy nhiên về nguyên lý chung của ELISA có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

Nguyên lý kỹ thuật:

Bƣớc 1: Sự có mặt của kháng nguyên hay kháng thể đặc hiệu trong mẫu thử đƣợc phản ứng với kháng thể hoặc kháng nguyên tƣơng ứng có sẵn trong cốc phản ứng (CLIA, ECLIA) hoặc đã đƣợc cố định sẵn trên pha rắn (ELISA), tạo nên phức hợp kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu.

Bƣớc 2: Nhận biết phức hợp miễn dịch đã đƣợc hình thành nhờ hệ thống chỉ thị màu với thử nghiệm ELISA, hoặc phát dòng photon ánh sáng, dòng này đƣợc ghi nhận bằng hệ thống đo tín hiệu ánh sáng đối với thử nghiệm CLIA/ECLIA [30], [31], [80].

Với ELISA thế hệ thứ nhất và thứ hai thì chất đánh dấu đƣợc gắn ở kháng thể. Chất đánh dấu gắn ở kháng nguyên là ELISA thế hệ thứ 3.

Cơ chất đƣợc dùng trong phần lớn kỹ thuật ELISA là chromogen và cơ chất này sẽ chuyển từ không màu sang có màu khi có chất xúc tác đặc hiệu, tuy nhiên xét nghiệm hóa phát quang các hệ thống xét nghiệm chuyên dụng lại sử dụng cơ chất là chất phát quang, loại chất phát quang thƣờng sử dụng trong xét nghiệm này là acridium. Tuy nhiên, cácxxét nghiệm này cần có các thiết bị chuyên dụng và đắt tiền để phát hiện tín hiệu [30], [31], [37].

 Ƣu điểm và hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch đánh dấu:

+ Ƣu điểm

- Cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu. Có thể sử dụng hệ thống máy tự động , giảm bớt thao tác cho ngƣời làm xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm.

- Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của ngƣời làm xét nghiệm.

- Các máy hóa phát quang, điện hóa phát quang cho kết quả nhanh trong vòng từ 10-20 phút và có công suất khá lớn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Có thể lƣu các bảng kết quả và các thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lƣợng xét nghiệm [37].

+ Hạn chế

- Cần có sự đầu tƣ cho trang thiết bị ban đầu và chế độ bảo dƣỡng, hiệu chuẩn, hiệu chỉnh máy móc định kỳ.

- Các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-80C).

- Thời gian thực hiện xét nghiệm ELISA từ 2-3 giờ.

- Chỉ thích hợp với những nơi có số lƣợng mẫu trên 40 mẫu/ngày [7], [50], [68].

Hình 1.9. Chất đánh dấu gắn ở kháng thể/kháng nguyên cho phép phát hiện

phức hợp KN-KT [31]

Nguyên lý kỹ thuật:

aha

KT trong thuốc thử KN đƣợc đánh dấu trong thuốc

thử Mẫu Phức hợp KN và KT KT đƣợc đánh dấu trong thuốc thử Mẫu Phức hợp KN và KT a) Chất đánh dấu gắn ở kháng thể b) Chất đánh dấu gắn ở kháng nguyên Formatted: Justified

Với ELISA thế hệ thứ nhất và thứ hai thì chất đánh dấu đƣợc gắn ở kháng thể. Chất đánh dấu gắn ở kháng nguyên là ELISA thế hệ thứ 3.

1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử NAT sử dụng trong sàng lọc máu 1.2.2.1. Kỹ thuật Real time PCR 1.2.2.1. Kỹ thuật Real time PCR

Nguyên lý: Real time PCR là một phƣơng pháp kiểm soát lƣợng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết đƣợc lƣợng sản phẩm đích trong từng chu kỳ của quá trình khuếch đại. Phân tích kết quả không cần phải qua bƣớc điện di trên gel nhƣ phản ứng PCR truyền thống. Kết quả đƣợc phân tích thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR. Kỹ thuật gồm 2 bƣớc: đó là tạo cDNA từ mạch khuôn là RNA và sau đó sử dụng cDNA này để thực hiện phản ứng real time PCR [36].

1.2.2.2. Phƣơng pháp khuếch đại qua trung gian phiên mã - TMA

Nguyên lý: Khuếch đại qua trung gian phiên mã (TMA) là kỹ thuật liên quan

đến phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt, sử dụng 2 enzyme: Enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase: RT) và T7 RNA polymerase để nhân rộng các mục tiêu RNA. RT là một enzyme sao chép ngƣợc đƣợc sử dụng để tạo ra phân tử DNA (complementary DNA: cDNA), tiếp theo mạch RNA trong phân tử RNA-DNA, cuối cùng nhờ tác dụng của mồi xuôi và enzyme T7 RNA polymerase mà mạch RNA mới

Formatted: Normal, Justified, Indent: First line: 1.27 cm, Font Alignment: Auto

sẽ đƣợc tổng hợp trên khuôn mẫu của mạch cDNA, quá trình này đƣợc lặp lại nhiều lần, kết quả là một lƣợng lớn RNA sẽ đƣợc tạo ra [36], [67], [74].

1.2.2.3. Kỹ thuật NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)

Nguyên lý: Kỹ thuật NASBA dùng cho các tác nhân có bộ gene là RNA mạch

đơn. Huyết tƣơng của bệnh nhân sẽ đƣợc qua bƣớc xử lý và thu RNA tinh sạch. Quá trình nhân bản RNA hoàn toàn giống kỹ thuật TMA. Tuy nhiên toàn bộ quá trình xảy ra trong điều kiện đẳng nhiệt (410C), các trình tự RNA sẽ đƣợc phát hiện nhờ mẫu dò đặc hiệu có đánh dấu huỳnh quang. Cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu sẽ đƣợc so sánh với cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu chuẩn đã biết trƣớc hàm lƣợng, từ đó suy ra hàm lƣợng chính xác của virus có trong mẫu phản ứng [74].

1.2.2.4. Roche Amplicor

Nguyên lý: Sau khi tách chiết, các trình tự đích của virus nhờ hoạt động của

enzyme phiên mã ngƣợc với sự có mặt của Mg++

cho phép cả hai bƣớc RT và PCR xảy ra trong một ống nghiệm. Sản phẩm PCR đã đƣợc đánh dấu với biotin sẽ đƣợc lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã đƣợc cố định trên các vi giếng và các trình tự đích đƣợc phát hiện theo nguyên lý của kỹ thuật ELISA [74]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

1.2.2.5. Kỹ thuật khuếch đại tín hiệu DNA nhánh (Brach DNA - bDNA)

Nguyên lý: Dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa DNA hoặc RNA, những mẫu dò

này là những trình tự có tính bảo tồn cao trong bộ gene của HBV, HCV, HIV. Mẫu huyết tƣơng đƣợc xử lý với proteinase K nhằm giải phóng DNA hoặc RNA đích. DNA/RNA đích đƣợc lai với các mẫu dò đặc hiệu. Phức hợp này sau đó đƣợc đƣợc cố định trên một vi giếng và tiếp tục đƣợc lai với các mẫu dò khuếch đại tín hiệu, mỗi

mẫu dò này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase, cuối cùng sản phẩm đích đƣợc phát hiện theo nguyên lý của kỹ thuật ELISA hoặc hóa phát quang [7], [74].

1.2.2.6. Phản ứng chuỗi Ligase

Nguyên lý: Phản ứng chuỗi ligase (Ligase chain reaction - LCR) sử dụng hai cặp mẫu dò, mỗi cặp mẫu dò bắt cặp với một mạch đơn của chuỗi axit nucleic đích. Sau khi kéo dài chuỗi axit nucleic theo hai chiều, 2 đoạn trình tự đƣợc tổng hợp trên một mạch đơn đƣợc nối với nhau nhờ các cơ chế sửa chữa của DNA ligase. Sử dụng enzyme DNA ligase, phản ứng có thể xoay vòng nhƣ trong PCR nhờ đó mà các sản phẩm đƣợc khuếch đại đạt đƣợc số lƣợng lớn lớn gấp hàng tỉ lần số lƣợng trình tự đích ban đầu [74].

1.3. TÌNH HÌNH SÀNG LỌC HBV, HCV, HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM NAM

1.3.1. Tình hình sàng lọc HIV, HCV, HBV ở ngƣời hiến máu trên thế giới 1.3.1.1. Tình hình sàng lọc HIV 1.3.1.1. Tình hình sàng lọc HIV

 Sàng lọc kháng thể HIV

- Xét nghiệm sàng lọc kháng thể kháng HIV-1 (anti-HIV1) đã nhanh chóng phát triển và đƣợc cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration: FDA) cho phép sử dụng từ năm 1985 [59].

- Năm 1992, Xét nghiệm sàng lọc HIV-2 đƣợc FDA công nhận và cho phép sử dụng trong sàng lọc máu [59].

- Sàng lọc kháng nguyên HIV p24 đã đƣợc chấp thuận cho phép sử dụng trong sàng lọc máu vào năm 1996 [59].

- Các kỹ thuật sử dụng để phát hiện KT-HIV và kháng nguyên p24 đã làm giảm nguy cơ lây truyền HIV qua đƣờng truyền máu từ 1/1.000 xuống còn 1/63.000 sản phẩm

máu đƣợc truyền; Sau đó, với những cải tiến về độ nhạy của xét nghiệm thì nguy cơ lây truyền HIV qua đƣờng truyền máu với ƣớc tính chỉ còn 1/110.000 sản phẩm máu, chế phẩm đƣợc truyền [59].

Hình 1.10. Diễn biến huyết thanh học của virus HIV và khoảng thời gian phát hiện

của các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện HIV [50]  Sàng lọc kháng nguyên p24

Sự phát hiện ra kháng nguyên HIV p24 và áp dụng sàng lọc kháng nguyên này trong truyền máu là một bƣớc tiến đáng kể, làm giảm thời gian cửa sổ phát hiện từ 3 đến 4 tuần so với phát hiện bằng phƣơng pháp tìm kháng thể, ngƣời ta ƣớc tính rằng nếu đƣa thêm xét nghiệm phát hiện kháng nguyên HIV p24 vào sàng lọc chi NHM thì sẽ ngăn chặn đƣợc khoảng 25% các trƣờng hợp truyền máu có nhiễm HIV, nhờ vậy sẽ làm giảm nguy nhiễm HIV qua con đƣờng truyền máu (1/450.000 sản phẩm máu đƣợc truyền) khi soanh sánhs với kỹ thuật chỉ sàng lọc bằng phƣơng pháp kháng thể (1/200.000 sản phẩm máu) [59].

 Sàng lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Với sự ra đời của kỹ thuật sinh học phân tử (NAT) đã giúp phát hiện thời gian cửa sổ nhiễm bệnh của ngƣời hiến máu có HIV sớm khoảng 11 ngày so với các kỹ

EIA phát hiện HIV p24 MP-NAT phát hiện HIV RNA

p24 ID-NAT phát hiện HIV RNA

p24

HIV RNA trong huyết tƣơng

thuật khác Năm 1999, kỹ thuật NAT cho phép phát hiện HIV và HCV đã đƣợc phát triển và đƣợc FDA cấp phép [50], [59].

Xét nghiệm NAT đƣợc thực hiện trên mẫu trộn (pool) của từ 16 đến 24 mẫu đơn khác nhau đƣợc gọi là "Minipool-NAT" viết tắt là MP-NAT, còn xét nghiệm NAT đƣợc thực hiện trên các mẫu đơn đƣợc viết tắt là ID-NAT (Individual-NAT). Đối với xét nghiệm sàng lọc thì NAT đƣợc thực hiện trên mẫu MP-NAT, vì MP-NAT làm giảm đáng kể chi phí xét nghiệm, nhƣng độ nhạy không giảm đáng kể và kết quả dƣơng tính giả ít hơn. Bất kỳ mẫu MP-NAT nào dƣơng tính đều phải đƣợc xác định lại trên mẫu ID-NAT [59].

Cho đến năm 2000, các trung tâm truyền máu ở Mỹ đã áp dụng thử nghiệm HIV bằng công nghệ NAT. Sau khi giới thiệu NAT, FDA cho phép ngƣng xét nghiệm phát hiện kháng nguyên HIV p24 ở những nơi mà đã triển khai xét nghiệm NAT để sàng lọc HIV cho ngƣời hiến máu [59].

Giai đoạn đầu khi áp dụng, xét nghiệm NAT- HIV đã giảm nguy cơ lây nhiễm HIV qua đƣờng truyền máu từ xấp xỉ 1/650.000 xuống còn khoảng 1/1.000.000 sản phẩm máu đƣợc truyền. Hiện nay sau nhiều cải tiến thì nguy cơ còn lại ƣớc tính chỉ còn trong khoảng từ 1/2.000.000 đến 1/5.000.000 sản phẩm máu đƣợc truyền [59].

Kết quả áp dụng kỹ thuật NAT để sàng lọc HIV hiện nay tại một số nƣớc trên thế giới

 Tại Đức

Từ năm 1997 đến 2005, qua sàng lọc NAT cho 31.524.571 đơn vị máu (chiếm 80% số máu thu thập trong cả nƣớc Đức) đã phát hiện đƣợc có 7 trƣờng hợp ngƣời hiến máu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Formatted: Left

Formatted: Justified, Indent: First line: 1.27 cm, Line spacing: 1.5 lines

dƣơng tính với HIV-1. Vì vậy, rủi ro HIV từ một sản phẩm máu ở Đức đƣợc ƣớc tính khoảng 1/4,3 triệu sản phẩm máu đƣợc truyền [59].

 Tại một số quốc gia đang phát triển

Ở một số quốc gia đang phát triển thì việc hạn chế lây truyền HIV qua con đƣờng truyền máu vẫn còn là vấn đề quan trọng và cần phải đƣợc quan tâm vì ở những nƣớc này tỷ lệ dân số khá cao, kiểm soát chất lƣợng, giám sát theo dõi và kiểm tra hệ thống còn kém, các nguồn lực tài chính để xét nghiệm HIV có nhiều hạn chế [59].

Bảng 1.2.So sánh nguy cơ lây nhiễm HIV khi thực hiện các kỹ thuật để phát hiện HIV khác nhau [59]

Bảng 1.2.So sánh nguy cơ lây nhiễm HIV khi thực hiện

CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG SÀNG LỌC HBV, HCV, H

Mục lục