Nguyên lý: Real time PCR là một phƣơng pháp kiểm soát lƣợng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết đƣợc lƣợng sản phẩm đích trong từng chu kỳ của quá trình khuếch đại. Phân tích kết quả không cần phải qua bƣớc điện di trên gel nhƣ phản ứng PCR truyền thống. Kết quả đƣợc phân tích thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR. Kỹ thuật gồm 2 bƣớc: đó là tạo cDNA từ mạch khuôn là RNA và sau đó sử dụng cDNA này để thực hiện phản ứng real time PCR [36].
1.2.2.2. Phƣơng pháp khuếch đại qua trung gian phiên mã - TMA
Nguyên lý: Khuếch đại qua trung gian phiên mã (TMA) là kỹ thuật liên quan
đến phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt, sử dụng 2 enzyme: Enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase: RT) và T7 RNA polymerase để nhân rộng các mục tiêu RNA. RT là một enzyme sao chép ngƣợc đƣợc sử dụng để tạo ra phân tử DNA (complementary DNA: cDNA), tiếp theo mạch RNA trong phân tử RNA-DNA, cuối cùng nhờ tác dụng của mồi xuôi và enzyme T7 RNA polymerase mà mạch RNA mới
Formatted: Normal, Justified, Indent: First line: 1.27 cm, Font Alignment: Auto
sẽ đƣợc tổng hợp trên khuôn mẫu của mạch cDNA, quá trình này đƣợc lặp lại nhiều lần, kết quả là một lƣợng lớn RNA sẽ đƣợc tạo ra [36], [67], [74].
1.2.2.3. Kỹ thuật NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)
Nguyên lý: Kỹ thuật NASBA dùng cho các tác nhân có bộ gene là RNA mạch
đơn. Huyết tƣơng của bệnh nhân sẽ đƣợc qua bƣớc xử lý và thu RNA tinh sạch. Quá trình nhân bản RNA hoàn toàn giống kỹ thuật TMA. Tuy nhiên toàn bộ quá trình xảy ra trong điều kiện đẳng nhiệt (410C), các trình tự RNA sẽ đƣợc phát hiện nhờ mẫu dò đặc hiệu có đánh dấu huỳnh quang. Cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu sẽ đƣợc so sánh với cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu chuẩn đã biết trƣớc hàm lƣợng, từ đó suy ra hàm lƣợng chính xác của virus có trong mẫu phản ứng [74].
1.2.2.4. Roche Amplicor
Nguyên lý: Sau khi tách chiết, các trình tự đích của virus nhờ hoạt động của
enzyme phiên mã ngƣợc với sự có mặt của Mg++
cho phép cả hai bƣớc RT và PCR xảy ra trong một ống nghiệm. Sản phẩm PCR đã đƣợc đánh dấu với biotin sẽ đƣợc lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã đƣợc cố định trên các vi giếng và các trình tự đích đƣợc phát hiện theo nguyên lý của kỹ thuật ELISA [74].
1.2.2.5. Kỹ thuật khuếch đại tín hiệu DNA nhánh (Brach DNA - bDNA)
Nguyên lý: Dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa DNA hoặc RNA, những mẫu dò
này là những trình tự có tính bảo tồn cao trong bộ gene của HBV, HCV, HIV. Mẫu huyết tƣơng đƣợc xử lý với proteinase K nhằm giải phóng DNA hoặc RNA đích. DNA/RNA đích đƣợc lai với các mẫu dò đặc hiệu. Phức hợp này sau đó đƣợc đƣợc cố định trên một vi giếng và tiếp tục đƣợc lai với các mẫu dò khuếch đại tín hiệu, mỗi
mẫu dò này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase, cuối cùng sản phẩm đích đƣợc phát hiện theo nguyên lý của kỹ thuật ELISA hoặc hóa phát quang [7], [74].
1.2.2.6. Phản ứng chuỗi Ligase
Nguyên lý: Phản ứng chuỗi ligase (Ligase chain reaction - LCR) sử dụng hai cặp mẫu dò, mỗi cặp mẫu dò bắt cặp với một mạch đơn của chuỗi axit nucleic đích. Sau khi kéo dài chuỗi axit nucleic theo hai chiều, 2 đoạn trình tự đƣợc tổng hợp trên một mạch đơn đƣợc nối với nhau nhờ các cơ chế sửa chữa của DNA ligase. Sử dụng enzyme DNA ligase, phản ứng có thể xoay vòng nhƣ trong PCR nhờ đó mà các sản phẩm đƣợc khuếch đại đạt đƣợc số lƣợng lớn lớn gấp hàng tỉ lần số lƣợng trình tự đích ban đầu [74].