Từ năm 1970, Khoa Huyết học Truyền máu, bệnh viện Bạch Mai và một số nơi trên cả nƣớc bắt đầu tiến hành kiểm tra kháng nguyên Au (kháng nguyên HBsAg) trên ngƣời hiến máu bằng kỹ thuật khuếch tán trên thạch [2].
Từ đầu những năm 1990 trở đi, việc sàng lọc cả 3 loại virus HBV, HCV, HIV mới đƣợc thực hiện một cách thƣờng quy tại Viện và một số bệnh viện lớn và cho đến này việc sàng lọc thƣờng quy HIV, HCV, HBV cho 100% ngƣời hiến máu vẫn tỏ ra hữu hiệu trong việc ngăn ngừa sự lây truyền HBV, HCV, HIV qua đƣờng truyền máu. Từ năm 1996 đến nay đã có những thống kê về tình hình lây nhiễm các virus qua đƣờng truyền máu [1], [2], [3], [17], [27], [35].
Từ năm 1997 đến 2002, tác giả Bùi Thị Mai An đã nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật mới bổ sung cho các kỹ thuật sàng lọc HIV, HCV cho ngƣời hiến máu tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng nhƣ: sử dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng nguyên HIV p24, kỹ thuật đo động học của enzyme ALT, kỹ thuật PCR để phát hiện HIV1 –RNA và HCV –RNA đã đƣợc tiến hành nghiên cứu để góp phần nâng cao hơn nữa chất lƣợng an toàn truyền máu [2].
Hiện nay phần lớn các trung tâm truyền máu nƣớc ta đã sử dụng kỹ thuật ELISA với thế hệ kít thứ 3 (phát hiện đƣợc cả hai loại kháng thể HIV loại IgG và IgM) và thế hệ thứ 4 (phát hiện cả kháng nguyên HIV p24, kháng thể HIV loại IgG và IgM). Do vậy có thể phát hiện đƣợc ngƣời hiến máu bị nhiễm HIV trong vòng từ 14 đến 38 ngày [59].
Từ ngày 01/1/2015 việc tiến hành kỹ thuật sinh học phân tử (NAT) trong sàng lọc máu ở Việt Nam chính thức đƣợc Bộ Y tế cho phép áp dụng để sàng lọc cả HBV, HCV và HIV ở ngƣời hiến máu. Ngày19/12/2014 Viện Huyết học – Truyền máu trung ƣơng đã đi đầu cả nƣớc trong việc triển khai xét nghiệm NAT thƣờng quy để sàng lọc các đơn vị máu tiếp nhận từ ngƣời hiến máu [38].
Kết quả thực hiện và áp dụng một số kỹ thuật sử dụng trong sàng lọc máu và tỷ lệ NHM dƣơng tính với các kỹ thuật sử dụng trong cả nƣớc trong giai đoạn vừa qua đƣợc thể hiện trong bảng 1.3 và bảng 1.4.
Bảng 1.3. Tỷ lệ HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV dƣơng tính thực hiện bằng các kỹ
thuật sàng lọc huyết thanh học ở ngƣời hiến máu tại Việt Nam
Tác giả, thời điểm nghiên cứu, đối tƣợng, địa dƣ
Sàng lọc huyết thanh học (ELISA) Tỷ lệ HBsAg (+) (%) Tỷ lệ KT-HCV (+) (%) Tỷ lệ KT-HIV (+) (%)
Đỗ Trung Phấn, 1996 -2000, Toàn quốc
[26] 4,27 1,42 0,11
Bùi Thị Mai An, 1997-2002, Viện HH-
TMTW [2] 3,23 2,6 0,015
Trần Ngọc Quế, 1998-2004, Viện HH-
TMTW [27] 6,53 1,26 0,14
Bạch Khánh Hòa, 2009-2011, Viện HH-
Vũ Thùy An, 2009-2011, Chợ Rẫy [3] 6,6 0,87 0,52 Nguyễn Thị Thu Hiền, 2008-2011, Hải
Phòng [15] 2,26 0,44 0,11
Lê Thị Hƣơng, 2007-2012, Hòa Bình [17] 2,9 0,4 0,05
Bảng 1.4. Tỷ lệ HCV, HIV dƣơng tính ở NHM khi áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Việt Nam giai đoạn 1997-2002 Tác giả, thời điểm nghiên cứu,
đối tƣợng, địa dƣ
Phát hiện RNA của virus bằng kỹ thuật PCR (tỷ lệ %)
HCV-RNA HIV-RNA
Bùi Thị Mai An, 1997-2002,
NHM, Viện HH-TMTW [2] 0,07 0
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu gồm:
- 390.012 lƣợt đơn vị máu tiếp nhận từ ngƣời hiến tại Viện Huyết học - Truyền máu TW từ 01/01/2013 đến 31/12/2014 và đƣợc sàng lọc HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV bằng kỹ thuật ELISA, hóa phát quang, điện hóa phát quang, trong đó gồm:
374.439 lƣợt đơn vị máu đƣợc tiếp nhận từ ngƣời hiến máu tình nguyện.
15.573 lƣợt đơn vị máu đƣợc tiếp nhận từ ngƣời cho máu chuyên nghiệp và
ngƣời nhà cho máu.
- 141.875 mẫu huyết tƣơng âm tính với các kỹ thuật sàng lọc đƣợc dùng để xét nghiệm NAT (HBV, HCV, HIV).
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu huyết thanh và huyết tƣơng đƣợc lấy trực tiếp từ ngƣời hiến máu, trong đó có:
Formatted Table
Formatted: Centered
Formatted: Centered, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
390.012 mẫu huyết thanh đƣợc dùng để sàng lọc HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV bằng kỹ thuật ELISA, hóa phát quang, điện hóa phát quang.
141.875 mẫu huyết tƣơng âm tính với các kỹ thuật sàng lọc trên đƣợc dùng để
xét nghiệm NAT (HBV, HCV, HIV).
2.2.2. Hóa chất xét nghiệm
Các hóa chất sinh phẩm đƣợc sử dụng để sàng lọc HBV, HCV, HIV: + Sinh phẩm sử dụng trong sàng lọc HBsAg:
- Biorad Monolisa HBsAg Ultra (ELISA) - Abbott Architect HBsAg Qualitative II (CLIA) - Roche Elecsys HBsAg II (ECLIA)
+ Sinh phẩm sử dụng trong sàng lọc HCV: - Biorad Monolisa HCV Ag-Ab Ultra - Abbott Architect anti- HCV (CLIA) - Roche Elecssys Anti HCV (ECLIA): + Sinh phẩm sử dụng trong sàng lọc HIV:
- Biorad Genscreen Ultra HIV Ag-Ab (ELISA) - Abbott Architech HIV Ag/Ab Combination (CLIA) - Roche Elecsys HIV COMBI PT (ECLIA)
+ Sinh phẩm sử dụng trong xét nghiệm NAT (HBV, HCV, HIV):
- Procleix Ultrio Elite Assay (sinh phẩm sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc). - Procleix HBV, HCV, HIV Discriminatory Assay (xét nghiệm phân biệt). - Multiplex v2.0 (MPX v2.0) (sinh phẩm sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc).
2.2.3. Trang thiết bị sử dụng trong xét nghiệm
- Hệ thống máy xét nghiệm tự động Abbott Architect i2000 (xét nghiệm huyết thanh học: HIV, HBV, HCV).
- Hệ thống máy xét nghiệm tự động Roche Cobas 8000 (xét nghiệm huyết thanh học: HIV, HBV, HCV).
- Hệ thống máy xét nghiệm tự động Etimax Hệ thống máy xét nghiệm tự động Roche Cobas 8000 (xét nghiệm huyết thanh học: HIV, HBV, HCV).
- Hệ thống máy xét nghiệm tự động EVOLIS và ELITE Hệ thống máy xét nghiệm tự động Roche Cobas 8000 (xét nghiệm huyết thanh học: HIV, HBV, HCV).
- Hệ thống máy xét nghiệm tự động Panther (xét nghiệm NAT) - Hệ thống máy xét nghiệm tự động Roche S201 (xét nghiệm NAT) - Máy ly tâm - Tủ lạnh: 2-80C, kho lạnh 2-80 C, tủ lạnh -250 C, nhà lạnh, -250 C 2.2.4. Dụng cụ sử dụng trong xét nghiệm
- Ống nghiệm lấy máu không có chất chống đông; - Ống nghiệm lấy máu có chống đông EDTA K2
- Bơm tiêm, đầu côn, cốc phản ứng cho các máy xét nghiệm hóa phát quang.... 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phƣơng pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiến cứu.
- Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Thực hiện theo các quy định hiện hành cho việc xét nghiệm sàng lọc các tác nhân gây bệnh HBV, HCV, HIV.
2.3.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
: Kỹ thuật ELISA, hóa phát quang (CLIA), điện hóa phát quang (ECLIA) * Nguyên lý kỹ thuật chung đƣợc sử
2.3.2.1. Các kỹ thuật miễn dịch đánh dấu dụng trong các xét nghiệm:
- Kỹ thuật Sandwich [78], ví dụ các sinh phẩm dùng để phát hiện HBsAg trong mẫu thử (thực hiện bằng kỹ thuật ELISA, hóa phát quang, điện hóa phát quang).
+ Kháng thể kháng chống virus có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN vi rú t đã đƣợc cố định trên giá đỡ . Phức hợp KN-KT sẽ đƣợc phát hiện bởi cộng hợp là các KN vi rút gắn các chất đánh dấu (men, chất hóa phát quang) khi cho phản ứng hiện màu với cơ chất hoặc phát ra ánh sáng.
Formatted: Normal, Justified, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
+ Giá trị mật độ quang (OD: optical density) của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lƣợng KT kháng virus hiện diện trong mẫu thử.
Kỹ thuật gián tiếp [78]: ví dụ các sinh phẩm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu : Abbott Architect anti- HCV (xét nghiệm trên hệ thống Architect), Roche Elecssys Anti HCV (trên hệ thống Roche Cobas 8000):
- Kháng thể kháng virus có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN vi rút đã đƣợc cố định sẵn trên giá đỡ. Phức hợp KN-KT này đƣợc phát hiện bởi một cộng hợp là một KT kháng globuline ngƣời (Ig) có gắn chất đánh dấu và sẽ cho phản ứng hiện màu/phát quang với một cơ chất thích hợp.
- Giá trị mật độ quang của phản ứng màu/phát quang tỷ lệ thuận với lƣợng kháng thể kháng virus hiện diện trong mẫu thử.
Kỹ thuật phát hiện đồng thời KN và KT [78], ví dụ các sinh phẩm Biorad Genscreen Ultra HIV Ag-Ab, Biorad Monolisa HCV Ag-Ab Ultra (xét nghiệm đƣợc thực hiện trên hệ thống máy EVOLIS, ELITE), Abbott Architech HIV Ag/Ab Combination (xét nghiệm trên hệ thống máy Abbott Architect i2000), Roche Elecsys HIV COMBI PT (xét nghiệm trên hệ thống máy Roche Cobas 8000) đều có khả năng phát hiện kháng nguyên và kháng thể chống virus có trong mẫu thử).
+ Các sinh phẩm này dùng kỹ thuật phát hiện đồng thời KN virus viêm (virus virus viêm gan C và HIV) cho phép phát hiện sớm nhiễm HCV/HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh. KN virus và KT kháng lại virus hiện diện trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN virus hoặc KT, phức hợp KN-KT sẽ đƣợc phát hiện bởi các cộng hợp gắn chất đánh dấu cho phản ứng hiện màu/phát quang sau khi cho cơ chất.
Nhận định và đánh giá kết quả [78]:
Nhận định và đánh giá kết quả theo quy trình chuẩn đã đƣợc Viện HH-TMTW phê duyệt trên cơ sở áp dụng hƣớng dẫn của nhà sản xuất trong việc thực hiện kiểm tra chất lƣợng và đánh giá kết quả xét nghiệm.
Trả kết quả cho đơn vị máu hiến đƣợc thực hiện theo sơ đồ chiến lƣợc I (áp dụng cho an toàn truyền máu): Mẫu đƣợc coi là dƣơng tính khi mẫu đó phản ứng với một xét nghiệm bằng sinh phẩm có độ nhạy cao. Trong an toàn truyền máu, cấy ghép
Formatted: List Paragraph, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.3 li, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0 cm + Indent at: 0.63 cm
Formatted: List Paragraph, Indent: Left: 0.63 cm, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
mô tạng, thụ tinh nhân tạo thì những đơn vị máu và sản phẩm máu hoặc mô, bộ phận cơ thể phải loại bỏ nếu có kết quả xét nghiệm dƣơng tính [40], [78].
2.3.2.2. Kỹ thuật NAT *Nguyên lý kỹ thuật NAT
Các phƣơng pháp xét nghiệm NAT theo nguyên lý TMA hoặc Real time PCR đang thực hiện tại Viện HHTMTW gồm 3 bƣớc thực hiện:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu (gồm các bƣớc tập trung virus và tách chiết axit nucleic của virus);
- Bƣớc 2: Khuếch đại DNA/RNA đích bằng nguyên lý TMA hoặc Realtime PCR - Bƣớc 3: Phát hiện sản phẩm đƣợc khuếch đại.
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp Realtime PCR [36]: Tính toán dựa trên giá trị ngƣỡng của phản ứng.
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp TMA
Các photon đƣợc đo bởi máy đo tín hiệu phát quang và đƣợc thông báo bằng đơn vị RLU (relative light units). Bất kỳ mẫu nào có tín hiệu “glower” trên giá trị cut- off là có phản ứng với HIV-RNA và/hoặc HBV-DNA và/hoặc HCV-RNA. Những mẫu này phải đƣợc xác định là phản ứng với loại virus nào bằng cách sử dụng những mồi đặc hiệu riêng cho loại virus đó trong kít chạy phân biệt Ultrio HBV, HCV, HIV [73].
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Hình 2.12. Đƣờng cong khuếch đại sản phẩm sau real time PCR [36]
+ Nhận định và đánh giá kết quả khi sử dụng phƣơng pháp TMA
Các photon đƣợc đo bởi máy đo tín hiệu phát quang và đƣợc thông báo bằng đơn vị RLU (relative light units). Bất kỳ mẫu nào có tín hiệu “glower” trên giá trị cut-off là có phản ứng với HIV-RNA và/hoặc HBV-DNA và/hoặc HCV-RNA. Những mẫu này phải đƣợc xác định là phản ứng với loại virus nào bằng cách sử dụng những mồi đặc hiệu
riêng cho loại virus đó trong kít chạy phân biệt Ultrio HBV, HCV, HIV [73].
2.3.3. Nội dung nghiên cứu
- Bƣớc 1: Thu thập mẫu và xử lý mẫu xét nghiệm (tách huyết thanh/huyết tƣơng). - Bƣớc 2: Thực hiện các kỹ thuật: ELISA, hóa phát quang, điện hóa phát quang để sàng
lọc huyết thanh học HBV, HCV, HIV cho ngƣời hiến máu, loại bỏ các mẫu máu dƣơng tính với HBsAg, anti-HCV, KN-KT HIV.
- Bƣớc 3: Thực xét nghiệm NAT (HBV, HCV, HIV): Nhằm nâng cao tính an toàn sinh
học của máu và chế phẩm máu.
- Bƣớc 4: Thu thập, nhập liệu kết quả nghiên cứu - Bƣớc 5: Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, SPSS 21.0
Formatted: Centered, Indent: First line: 0 cm, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Centered, Indent: First line: 0 cm, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
43
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 21.0
2.5. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Mọi thông tin thu thập đƣợc đảm bảo tính bí mật cho ngƣời hiến máu, chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đƣợc sự đồng ý của ngƣời hiến máu và phê duyệt của Ban Lãnh đạo Viện, Lãnh đạo Khoa.
Kết quả nghiên cứu đƣợc phản hồi cho Viện và Khoa.
Từ kết quả nghiên cứu, lựa chọn một số thông tin cần thiết và có ích để khuyến cáo những vấn đề liên quan đến sàng lọc các tác nhân HBV, HCV, HIV lây qua đƣờng truyền máu.
Mẫu máu của ngƣời cho (n = 390.012)
Mục tiêu 1: Nghiên cứu kết quả sàng lọc
HBV, HCV, HIV ở ngƣời hiến máu
- Kỹ thuật ELISA - Kỹ thuật hóa phát quang - Kỹ thuật điện hóa phát quang
Mẫu máu dƣơng tính với Mẫu máu âm tính với
Formatted: Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Font:
Formatted: List Paragraph, Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.2 li, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.63 cm + Indent at: 1.27 cm
Formatted: List Paragraph, Left, Space Before: 0 pt, After: 0 pt, Line spacing: single
Formatted: List Paragraph, Don't add space between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.2 li, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.63 cm + Indent at: 1.27 cm
Formatted: Space Before: 3 pt, After: 3 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li
Sơ đồHình 2.21. Sơ đồ nghiên cứu theo mục tiêu
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 21.0
2.5. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Mọi thông tin thu thập đƣợc đảm bảo tính bí mật cho ngƣời hiến máu, chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đƣợc sự đồng ý của ngƣời hiến máu và phê duyệt của Ban Lãnh đạo Viện, Lãnh đạo Khoa.
Formatted: Normal
Kết quả nghiên cứu đƣợc phản hồi cho Viện và Khoa.
Từ kết quả nghiên cứu, lựa chọn một số thông tin cần thiết và có ích để khuyến cáo những vấn đề liên quan đến sàng lọc các tác nhân HBV, HCV, HIV lây qua
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV dƣơng tính ở NHM tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng năm 2013-2014
Bảng 3.1. Tỷ lệ HBsAg dƣơng tính ở ngƣời hiến máu
Tên xét nghiệm Số mẫu
nghiên cứu Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) p
HBsAg test nhanh 266.479 16.930 6,35
p > 0,05 HBsAg
(ELISA/CLIA/ECLIA) 390.012 3.961 1,04
Qua Bbảng 3.1 cho thấy tỷ lệ HBsAg dƣơng tính test nhanh ở ngƣời hiến máu lần đầu trong năm 2013 và 2014 lần lƣợt là 6,35%. Tỷ lệ HBsAg dƣơng tính ở các đơn vị máu tiếp nhận tại Viện HH-TMTW là 1,04%, chƣa thấy sự khác biệt giữa tỷ lệ dƣơng tính với HBsAg bằng test nhanh và tỷ lệ dƣơng tính với HBsAg bằng các kỹ thuật sàng lọc ELISA/CLIA/ECLIA, với p> 0,05.
Tỷ lệ HBsAg test nhanh dƣơng tính ở ngƣời hiến máu lần đầu trƣớc khi tham gia hiến máu trong nghiên cứu của chúng tôi là 6,35%, kết quả nghiên của chúng tôi cao hơn so với nghiên cứu của các tác giả: Phạm Văn Chiến (2012) tại Viện HH-