III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3.Các thí nghiệm trong phòng
3.3.3.1. Các thí nghiệm liên quan đến chất lượng của gạo.
Các phương pháp này đã được tiến hành theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa của IRRI, 1996” [28].
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 36
a, Đo chiều dài gạo xay
Hình dạng hạt gạo được đo sau khi gạo được bóc vỏ trấu, làm trắng. Theo tiêu chuẩn của IRRI (1996), có thể chia hạt gạo thành các loại sau:
Theo chiều dài gạo: Quá dài: >7,5mm Dài: 6,6 - 7,5mm Trung bình: 5,5 - 6,6mm Ngắn: <5,5mm
b, Dạng hình gạo xay
Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng hạt gạo trắng bằng thước pame. Mỗi giống đo 5 hạt, lấy trung bình chiều dài và chiều rộng. Dạng hình gạo xay được đánh giá bằng tỷ số dài/rộng theo tiêu chuẩn của IRRI (1996):
Dạng hình Tỷ số (D/R)
Thon dài > 3,0
Trung bình 2,1 - 3,0
Bầu 1,1 – 2,0
Tròn <1,1
c, Mùi thơm của gạo
Lấy 10 hạt gạo trắng mỗi giống và nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi giống được đặt trong một hộp kín chứa 500µl KOH 1,7% đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi thơm (IRRI, 2000) bằng phương pháp ngửi, mức độ thơm được đánh giá bởi 5 người và cho điểm theo 3 mức:
Điểm 1: Không thơm Điểm 2: Hơi thơm Điểm 3: Thơm
d, Đánh giá độ phá hủy kiềm và nhiệt độ hóa hồ
Chỉ tiêu này được đánh giá theo phương pháp của Little, 1958, với quy trình như sau: 6 hạt gạo nguyên đã xay sát trắng được ngâm vào dung dịch KOH 1,7% trong 23 giờ ở nhiệt độ phòng 300c.
Độ phá hủy kiềm và nhiệt độ hóa hồ của các mẫu giống được quan sát và đánh giá theo thang điểm như sau:
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 37
Thang
điểm Độ lan rộng Độ trong suốt
Độ phá hủy kiềm
Nhiệt độ hóa hồ
1 Hạt gạo còn nguyên Hạt gạo trắng bột Thấp Cao
2 Hạt gạo phồng lên Gạo trắng bột, có viền
trắng xung quanh Thấp Cao 3 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay rõ nét Hạt gạo trắng bột, viền nhòe như bông gòn,
vẩn đục Thấp – Trung bình Cao – Trung bình 4 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay mở rộng
Tâm nhòe như bông gòn, viền vẩn đục
Trung bình Trung bình
5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hạt gạo rã ra, viền hoàn toàn và mở rộng
Tâm nhòe như bông gòn, viền trong suốt
Trung bình Trung bình
6 Hạt tan hoàn toàn
hòa chung với nhau
Tâm đục, viền trong suốt
Cao Thấp
7 Hòa tan hoàn toàn
và quyện vào nhau
Tâm và viền trong suốt
Cao Thấp
d, Kiểm tra gen mùi thơm
*Chiết tách DNA
Chiết tách DNA theo quy trình của Zheng & cs,1995, có cải tiến:
Tiến hành cắt lá vào lúc sáng sớm, chọn những lá còn non dài 2cm, không bị sâu bệnh bỏ vào ống nghiệm có dung dịch 1,5cm, đánh dấu tên giống rồi đặt vào đá lạnh.
Trong phòng thí nghiệm, các cối chày sứ đã được hấp khử trùng và đặt trên đá lạnh.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 38
2. Nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào chối chày sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá.
3. Nghiền kỹ mô lá đến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh đen, chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
4. Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào, trộn lẫn và chuyển 400µl vào ống nghiệm đã đánh dấu theo tên giống ban đầu.
5. Đổ vào ống nghiệm 400µl (25 phenol: 24 chloroform: 1 isoaminachohol) trộn đều, quay ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút sau đó chuyển phần dung dịch lớp bên trên sang ống nghiệm mới đã đánh số theo từng tên giống
6. Đổ vào ống nghiệm 400µl (24 chlorofrom: 1 isoaminachohol) làm tương tự như bước 5.
7. Đổ 800µl ethanol (Isopropanol) trộn đều sau đó ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút. Đổ phần dung dịch phía trên đi, giữ lại phần kết tủa ở đáy ống nghiệm.
8. Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm trên giấy thấm.
Phần kết tủa chính là DNA, hòa tan DNA kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C hoặc 40C, dùng cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Để phát hiện gen mùi thơm fgr, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR: - Chuẩn bị DNA của 50 mẫu giống nghiên cứu và các giống đối chứng (Giống Bắc thơm mang gen quy định mùi thơm fgr, giống IR64 không mang gen quy định mùi thơm), sử dụng cặp mồi theo nghiên cứu của Bradbury và cs, 2005 có trình tự như sau:
Trình tự Tác giả
ESP 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’ IFAP 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’
Bradbury và cs, 2005
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 39 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thành phần gồm: 20µl dung dịch phản ứng PCR gồm có: 14 µl nuclease - Free water, 2.5 µl buffer, 0.4 µl dNTP 25mM, 1 µl Primer ESP, 1 µl Primer IFAP, 0.1 µl dream taq polymerase, 1 µl DNA mẫu.
- PCR chạy theo chu kỳ:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 phút 2 94 30 giây 3 58 30 giây 4 72 30 giây 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 5 phút 7 4 8 Kết thúc * Điện di sản phẩm PCR
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ được chạy điện di để phát hiện gen fgr.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V.
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng Ethidium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
Kết quả mẫu giống có chứa gen thơm (fgr) sẽ xuất hiện một vạch có kích thước 257bp trùng với giống đối chứng dương Bắc thơm và các mẫu giống không chứa gen sẽ không có vạch nhân lên như giống đối chứng âm IR64.
3.3.3.2. Xác định gen kháng Xa4, xa5, Xa7 bằng phương pháp PCR
*Tiến hành phản ứng PCR
- Chuẩn bị DNA của 50 mẫu giống nghiên cứu và các dòng chỉ thị (gồm: IR24 - đối chứng âm không chứa gen kháng, IRBB4, IRBB5 và IRBB7 - đối chứng dương chứa gen kháng Xa4, xa5, Xa7).
- Thành phần dung dịch phản ứng PCR gồm:
+ Đối với Xa4 và Xa7 thành phần 25 µl gồm: 12.5 µl taq master mix, 1 µl Primer Forward, 1 µl Primer Revese, 1 µl DNA mẫu và 9.5 µl nuclease -
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 40
Free water.
+ Đối với xa5 thành phần 20 µl gồm có: 14.24 µl nuclease - Free water, 2.5 µl buffer, 0.16 µl dNTP 25mM, 1 µl Primer Forward, 1 µl Primer Revese, 0.1 µl dream taq polymerase, 1 µl DNA mẫu.
- Các mồi sử dụng để phát hiện ra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7
Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Chỉ thị NST Trình tự mồi Gen LK Khoảng cách cM Tài liệu tham khảo MP 11 F:5’-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA- GG-3’ R:5’-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC- GGG-3’ Xa-4 1.7cM Yoshida et al, 1992 RG556 5 F: 5’ -TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT- GC-3’ R: 5’-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC- TC-3’ xa-5 0 -1 cM Me Couchetal. 1999 P3 6 F:5’-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA- GTG-GTT-3’ R: 5’-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT- CAT-GGA-3’
Xa-7 2.5cM Taure etal, 2003
- Chu trình nhiệt cho Xa4, Xa7 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 56 1 phút 4 72 2 phút 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 8 phút 7 4 8 Kết thúc
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 41
- Chu trình nhiệt cho xa5 như sau:
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 60 1 phút 4 72 1 phút 50 giây 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 7 phút 7 4 8 Kết thúc
* Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ được chạy điện di để phát hiện gen kháng.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V.
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng Ethidium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di để xem có gen kháng hay không. Phát hiện bằng cách so sánh kích cỡ băng nhân của mỗi mẫu với kích thước vệt băng của giống đối chứng, nếu vạch nào trùng với vạch của giống đối chứng âm là giống không mang gen kháng, vạch nào trùng với đối chứng dương là có chứa gen kháng.
* Phản ứng cắt DNA sản phẩm PCR phát hiện gen xa5
Riêng gen xa5 sau khi điện di sản phẩm PCR thấy có DNA được nhân lên, tuy nhiên vẫn chưa phân biệt được vệt băng của dòng mang gen xa5 với vệt băng IR24. Do đó cẩn phải dùng enzym cắt giới hạn RE (dùng enzym
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 42
Thành phần 15µl dung dịch cắt bằng enzym DraI như sau: Nuclease free water: 3,2µl; 10X buffer: 1,5µl; enzym Dral 10unit/µl: 0,3µl; Sản phẩm PCR: 10µl.
Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 370c với thời gian từ 6h đến qua đêm. Điện di sản phẩm DNA đã được cắt bằng enzym Dral trên gel agarose 1,5%.