II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3.7. Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá
2.3.7.1. Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá
a, Nghiên cứu về chủng nòi và sự phát triển của bệnh bạc lá.
Trong những năm gần đây, bệnh bạc lá lúa phát triển trên diện rộng và càng trở nên nghiêm trọng. Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá
Xanthomonas oyzae pv. oryzae cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng. Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng (Tika B. Adhikari, T.W. Mew và CTV, 1999) [51].
Năm 2005, Nguyễn Văn Viết và cs đã tiến hành nghiên cứu bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc. Kết quả nghiên cứu cho thấy các nhóm nòi bệnh thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm nòi, trái lại một nhóm nòi có thể hiện diện ở nhiều địa phương.
Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta. Cũng theo PGS.TS. Phan Hữu Tôn (2002-2005)[23] hiện nay bộ môn Công nghệ sinh học và phương pháp thí nghiệm đã phân lập được 10 chủng đang tồn tại ở Miền Bắc Việt Nam. Trong đó hai chủng 2 và 3 phổ biến ở vùng đồng bằng sông Hồng những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm cho dù xuất hiện với tần suất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho các giống lúa (Phan Hữu Tôn, 2005) [25].
Và gần đây nhất, trong chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập nuôi cấy đã xác định được 16 chủng vi khuẩn Xanthonas oryzae p.v oryzae gây bệnh khác
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 22
nhau (Tạp chí KHKT, 2009).
Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở Miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng hơn, vì vậy mà đòi hỏi phải tạo ra những giống lúa mang nhiều gen kháng bệnh có tính kháng ngang bền vững hơn.
b, Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá
Các nhà khoa học Nhật Bản là những người đi đầu trong việc nghiên cứu tính di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá lúa. Cho đến những năm 60, IRRI đã xác định được bản chất di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa là do gen quy định. Nishimura (1961) khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông đã phát hiện khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng là Kogyoku và Kaganeman được điều khiển bởi một gen trội nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (theo thứ tự NST do ông quy định) [41].
Murty và CS, 1973, khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá của các giống lúa Sigadis, TKM6, BJ1, Wase Aikoku 3, PI 215936, Zenith và B589 A4-18-1 đã chỉ ra rằng các giống lúa này có ít nhất đến 3 Xa-gen kháng các nhóm nòi vi khuẩn.
Năm 1977, Petpisit và CS trình diễn thí nghiệm khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá lúa của các giống IR20, IR22, IR1529-680-3, đã xác định và đặt tên một gen kháng trội là Xa-4 [16].
Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá được thực hiện tại Nhật Bản và Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) từ năm 1960 đến nay kết quả đã xác định được 31 gen kháng bệnh bạc lá lúa ký hiệu từ Xa-1 đến
Xa-31 đồng thời người ta cũng đã thiết kế được các gen mồi (Primer) để xác định và phát hiện các Xa-gen của các giống lúa khác nhau chưa được nghiên cứu. Các gen kháng được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau: gen kháng nguyên thủy có sẵn trong các giống lúa trồng, gen kháng được tạo bởi đột biến như xa19, xa20, Xa25, hoặc gen kháng có nguồn gốc từ các giống lúa dại như
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 23
Ở miền Bắc Việt Nam, hiện có 4 gen kháng hữu hiệu đối với hầu hết các chủng vi khuẩn bạc lá là Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21 (theo Phan Hữu Tôn, 2006) [24, 26].
Theo Nino –Liu và CS, xa5 là gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ
rộng (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều race Xoo của Philippin và Việt Nam). xa5 mã hóa tiểu phần γ của yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hoàn chỉnh ký hiệu là TFIIAγ). Tính kháng lặn của xa5 có thể được giải thích như sau : xa5 và Xa5 mã hóa các isoform của TFIIAγ (chỉ khác nhau ở aa số 39) và do đó có ái lực liên kết khác nhau với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD) của AvrXa5 của vi khuẩn (AvrXa5 là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn). AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen trội trên giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh. Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn trên giống kháng) dẫn tới các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh không được biểu hiện, hậu quả là cây kháng bệnh [46].
Khả năng kháng bệnh của một cá thể có thể do một gen trội, một gen lặn, một gen trội không hoàn toàn hoặc do các gen cùng liên kết quy định. Vì vậy mức độ kháng bệnh bạc lá của các gen khác nhau [50]. Các gen kháng bệnh bạc lá là gen trội (Xa) hay gen lặn (xa) đều có ý nghĩa đối với việc chọn giống. Nhóm gen lặn chỉ biểu hiện được khả năng kháng khi ở dạng đồng hợp nên nhóm này chỉ có ý nghĩa với việc chọn giống lúa thuần, còn nhóm gen trội có ý nghĩa đối với cả việc chọn giống lúa lai và giống lúa thuần.
Theo thuyết “gen đối gen” của Flor (1956) với mỗi gen kiểm soát tính kháng bệnh của kí chủ thì có một gen đặc thù kiểm soát tính gây bệnh trong kí sinh. Hay cứ mỗi một gen quy định tính độc (VIR – genes) của kí sinh thì cũng có một gen quy định tính kháng tương ứng trong cây kí chủ [53]. Mỗi vùng địa lí khác nhau tồn tại những nòi sinh lí khác nhau, điều này giải thích được tại sao những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này lại bị nhiễm bệnh nặng ở vùng khác. Vì vậy, để chọn tạo giống kháng bệnh phù hợp với
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 24
từng vùng sinh thái khác nhau cần xác định được nòi sinh lí, khu vực phân bố và khả năng kháng của gen đối với nòi đó [31]. Tại mỗi vùng sinh thái khác nhau, vi khuẩn Xanthomonas Oryzae tồn tại nhiều chủng khác nhau, có thể là chủng phổ biến hay chủng ít phổ biến. Do đó chiến lược chọn tạo giống kháng hiện nay là tổ hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giống để tăng phổ kháng cho giống và tăng độ bền của gen kháng.
Cơ chế kháng bệnh: Mỗi giống có khả năng kháng dọc, kháng ngang
khác nhau là do loại gen kháng và lượng gen kháng quy định.
Tính kháng dọc (vertical resistance) còn gọi là tính kháng chuyên biệt đối với các nòi sinh lý, tính kháng không đồng nhất, tính kháng chất lượng, tính kháng không bền vững. Nói cách khác một giống có thể kháng tuyệt đối với nòi này nhưng lại mẫn cảm với nòi khác của cùng một loài vi khuẩn gây bệnh. Xét về mặt di truyền, tính kháng dọc đồng nghĩa với tính kháng đơn gen, kháng tuyệt đối.
Ngược lại tính kháng ngang (horizontance resistance) là phản ứng kháng tương đương nhau với hầu hết các nòi và được kiểm soát bởi nhiều gen. Tính kháng này còn được gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng đồng nhất, tính kháng đa gen [6].
Do sự khác nhau về bản chất di truyền nên khả năng kháng ngang và kháng dọc ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh rất khác nhau. Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban đầu và trì hoãn sự bùng nổ của dịch bệnh song thời gian tồn tại khả năng kháng dọc phụ thuộc vào sự đa dạng di truyền trong quần thể ký sinh. Kháng ngang không làm giảm bớt nguồn bệnh ban đầu nhưng lại làm giảm tốc độ phát triển của dịch bệnh. Do đó kháng ngang có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc [6].
Tính kháng bệnh bền vững là khả năng duy trì tính kháng trong khoảng thời gian dài trong môi trường sống thuận lợi cho ký sinh gây bệnh (Johnson,
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 25
1984). Khả năng kháng bệnh bền vững có thể có được ở những giống chứa hai hay nhiều gen kháng đặc thù với từng nòi sinh lý. Chỉ khi các nòi này đồng thời tạo nên nhiều đột biến độc lập mới có thể phá vỡ hàng rào kháng bệnh của giống đó [6]. Thông qua phân tích di truyền, người ta có thể dựa trên kiểu hình của tính kháng bệnh bền vững để giải thích cơ sở di truyền của nó. Trên thực tế tính kháng bệnh bền vững thường kết hợp với tính kháng không chuyên tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết về mối quan hệ này vẫn chưa rõ ràng trên cơ sở sinh hóa học. Với kỹ thuật PCR, người ta có thể tìm kiếm những gen kháng chính, những gen như vậy có thể nhanh chóng được phân lập và đánh dấu phân tử. Nhờ vậy, sự phối hợp lại các gen kháng sẽ giúp cho tính kháng trở nên ổn định hơn. Do đó, trong công tác chọn giống kháng bệnh, các nhà khoa học rất chú ý đến việc tìm nguồn gen kháng phong phú với mỗi nòi ở các vùng sinh thái khác nhau. Từ đó, tổ hợp vào một giống để tăng khả năng kháng bệnh bền vững của một giống, đây là mục tiêu chiến lược trong giai đoạn hiện nay.
Việc xác định nguồn gen triển vọng của cây lúa cùng với những đặc tính có lợi là một hoạt động quan trọng trong chương trình cải tiến giống lúa. Tiềm năng di truyền của các nguồn vật liệu lai tạo, dù được tạo ra bởi các phương pháp truyền thống hay bằng công nghệ hiện đại, đều được đánh giá qua các biểu hiện ngoại hình trong các môi trường thí nghiệm chứa các yếu tố cần quan tâm. Vì vậy cần phải sử dụng các phương pháp đánh giá thận trọng, chính xác, nhanh và đủ tính thực tiễn.
c, Các phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh
Dựa trên cơ sở của tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, cho đến nay phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất là phương pháp lai hữu tính, thông qua phương pháp này ta có thể chuyển những gen có khả năng kháng bệnh cao vào các giống có đặc tính
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 26
nông sinh học quý thông qua Backcross.Từ đó mà nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra. Khả năng kháng bạc lá thường do đơn gen quy định, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại để chuyển gen kháng là rất hiệu quả. Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết để lai lại với một giống mang gen kháng hữu hiệu. Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới được tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm được gen kháng mong muốn. Trong quá trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly để đẩy nhanh quá trình.
Phương pháp lai hữu tính được tiến hành đầu tiên ở Nhật Bản từ cây lúa chống bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1926 (Jennings và ctv,1979) [38]. Đến nay trên Thế giới đã có rất nhiều nước áp dụng rộng rãi phương pháp này trên cả lúa thuần và lúa lai. Đặc biệt Trung Quốc là một trong những nước áp dụng rộng rãi nhất phương pháp này, họ đã chuyển được một số gen có khả năng chống bệnh cao vào một số giống quan trọng trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng. Điển hình là gen Xa-21 có phổ kháng rộng đối với các nòi vi khuẩn đã được chuyển thành công vào “Munghu63” là một dòng phục hồi được sử dụng rộng rãi trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng [5].
Phương pháp lây nhiễm nhân tạo được sử dụng để xác định con lai có mang gen kháng hay không. Nhưng bằng phương pháp này đôi khi khó phân biệt được các gen kháng khác nhau, nếu chúng cùng biểu hiện một số phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương ứng. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR dựa trên các trình tự ADN liên kết chặt chẽ với gen kháng từ đó mà có thể xác định các gen kháng dễ dàng và hiệu quả hơn. Tại viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Bùi Chí Bửu cùng cộng sự đã sử dụng PCR để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa-4, xa5, xa13 với độ chính xác cao [1].
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 27
Ngoài ra, hiện nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi và lai tế bào. Bằng phương pháp cứu phôi Anude. Border và cộng sự (1992) đã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (Theo k.s Lee và cộng sự). Bằng cánh lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae sativa L
với nguồn cho gen kháng là lúa dại Oryzae (Meyeriana), Cheng-qui Yan và cộng sự đã tiến hành thành công việc tạo dòng tế bào mang gen kháng bạc lá. Kết quả thu được 29 dòng cây lai xoma, hình thái biểu hiện giống cả hai bên bố mẹ, trong đó có 2 dòng biểu hiện tính kháng cao, 8 dòng biểu hiện tính kháng vừa (Cheng-qui Yan và cộng sự, 2004)
Bên cạnh đó còn có phương pháp gây đột biến Invitro cũng tạo ra tính kháng, làm thay đổi một số tính trạng nông sinh học cho giống, phương pháp này bước đầu đã được thực hiện và thành công ở trên cây lúa, ngô và khoai tây...
2.3.7.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá.
Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. oyzae có thể được xác định nhanh chóngbằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku, 2000, đề xuất sử dụng 2 đoạn mồi XOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn ADN, đoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá (Phan Hữu Tôn, 2005) [25]
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã thu được 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4,
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 28
4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Đồng thời Bùi Chí Bửu và Cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với độ chính xác cao (NguyenVinh Phuc, 2005).
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh. Từ năm 2000, cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu