III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1.1. Thí nghiệm ngoài đồng ruộng
- 70 mẫu giống lúa nếp cẩm được thu thập và bảo quản tại Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng -Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và Trung Tâm tài nguyên thực vật -Viện khoa học Nông Nghiệp Việt Nam (Kí hiệu, tên, nguồn gốc các mẫu giống được trình bày chi tiết tại Phụ lục 1);
- Các giống đối chứng TK90, Bắc thơm và IR64;
- Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau, gồm dòng nhiễm chuẩn IR24, các dòng mang gen kháng chuẩn gồm IRBB4, IRBB5 và IRBB7 lần lượt chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7;
- 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam được phân lập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng như sau:
Bảng 3.1. Chủng vi khuẩn (race) được phân lập và sử dụng
STT Chủng Ký hiệu Phân lập
từ giống Địa điểm thu thập
1 Race 1 HAU01030-3 or 01043 Khang dân Trung Rã, Sóc Sơn, Hà Nôi 2 Race 2 HAU02009-2 Tẻ thơm (BT7) Xuân Canh, Đông Anh,Hà Nội 3 Race 3 HAU02012-2 Tẻ thơm 2 (BT7) Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 4 Race 4 HAU01008-1
Tẻ thơm (BT7) Cộng Hòa, Chí Linh, Hải Dương 5 Race 5 HAU02013-1
Khang dân Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh 6 Race 6 HAU02034-3
Khang dân Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh 7 Race 7 HAU02019-1
Bắc thơm 7 Anh Dũng,Kiến Thụy, Hải Phòng 8 Race 8 HAU02020-1
Nếp 87 Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định
9 Race 9 HAU02019-2
Nếp 87 Nam Hồng,Trực Ninh, Nam Định 10 Race 10 HAU02037-1
Nhị ưu 838 Nam Xá, Trực Ninh, Nam Định
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 31
3.1.1.2. Thí nghiệm trong phòng
+ Các cặp mồi để phát hiện gen Xa4, xa5, Xa7 và fgr. + Hóa chất dùng để chiết tách DNA.
Thành phần dung dịch đệm chiết tách DNA
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Lượng cần cho 10ml dd tách chiết Tris - HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5 ml EDTA (pH= 8) 0,5M 0,25mM 0,5ml NaCl 5M 300mM 0,6ml SDS 10% 1% 1,0ml H2O 7,4ml Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Lượng cần cho 50ml dung dịch TE làm việc Tris-HCl (pH=8) 1M 10mM 0,5ml EDTA (pH =8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
+ Hóa chất dùng cho chạy điện di trên gel agarose: Agarose 1%, ethidium bromide 10mg/ml, Loading Buffer (Bromophenol blue, Xylene cyanol, Succarose)
+ TAE (Tris Base, glacial acetic acid, EDTA) 1X, DNA (DNA chuẩn đã biết trước nồng độ).
+ Trang thiết bị máy móc trong phòng: máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh điện di, máy li tâm, máy votex, tủ lạnh, lò vi sóng, các loại ống eppendorf, các loại pipet và đầu tuýp đi kèm.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 32