VII. Xác định hàm lƣợng vitamin
4. Xác định vitami nA
Caroten thuộc loại sắc tố màu đỏ, vàng có trong thực vật và động vật, được coi là
tiền vitamin A. Dưới tác dụng của men carotenaza, caroten tạo nên vitamin A. Thông
thường 1 vitamin A bằng 3 caroten.
Do đó, tác dụng của vitamin A và i đối với cơ thể giống nhau nên khi phân tích có thể xác định riêng caroten hoặc xác định tổng hợp lượng caroten và vitamin A.
* Xác định caroten bằng phương pháp sắc ký cột.
a. Nguyên tắc:
Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem so với mẫu.
b. Dụng cụ, hoá chất:
- Cân phân tích, bình định mức thể tích 50ml, 100ml; cối sứ, máy đo màu.
- Cột sắc ký dài 30cm; = 1cm. - Cát tinh thể: Dùng rây = 4 – 5 mm để rây cát. Rửa cát bằng nước rồi dùng HCl (tỷ lệ 1: 1) cho vào cát; ngâm 1 đêm. Rửa sạch cát, rửa lại bằng nước cất rồi sấy khô.
- Benzen: nhiệt độ sôi 70 – 800C.
A: Bình hứng; B – Bình nối với hệ thống hút chân không; C – Hệ thống hút chân không; D – Cột nhôm ôxyt.
- Chất hấp phụ: Al2O3 loại dùng cho sắc ký, sấy ở 1.000C trong 1 giờ. - Na2SO4 khan.
- Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân 0,145g azobenzen cho vào bình định mức 100ml, thêm rượu etylic tới vạch định mức.
Khi thí nghiệm, đem dung dịch này pha loãng gấp 10 lần bằng dung dịch rượu etylic
96%. Bảo quản nơi tối.
c. Các bước tiến hành:
Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ, nghiền kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút. Làm khô kỹ, cho thêm vào cối 10g Natri sunfat khan, nghiền tiếp trong 30 phút.
Phần dưới cột sắc ký nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được nhồi nhôm ôxít tới 2/3 cột. Dùng đũa thuỷ tinh nhồi chặt, trên cùng đặt một lớp bông dày 1cm.
Bột khô từ cối cho vào cột sắc ký. Cho benzen vào cột tới khi lớp bột không thấm
benzen nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rửa chậm bằng benzin tới khi
không thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần cho benzin phủ ngập lớp bột, vì caroten dễ bị oxy hoá trong không khí.
Hình 4.5. Cột sắc
ký xác định caroten Hình 4.8. Dụng cụ tách caroten
Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc 100ml tuỳ thể tích nước hứng được và thêm benzin tới vạch mức. Dung dịch caroten này đem so màu với azobenzen tiêu chuẩn đã pha loãng 10 lần.
d. Tính kết quả:
Hàm lượng caroten (mg trong 100g sản phẩm) được tính: X = G D D V m tc . . . 100 . 00235 , 0 ở đây:
V - là dung tích bình định mức chứa dung dịch caroten trong benzin (ml). G - là trọng lượng mẫu (g).
Dtc- là mật độ quang hoặc chiều cao thước (trên máy Dubốt) của dung dịch azobenzen
tiêu chuẩn (mm).
Dm - là mật độ quang hoặc chiều cao thước của dung dịch caroten (mm).
(xem Hình 4.7 và 4.8).