VII. Xác định hàm lƣợng vitamin
3. Xác định hàm lượng vitamin B1 bằng huỳnh quang kế
a. Nguyên tắc:
Vitamin B1 còn gọi là Thiamin hay aneurin là loại vitamin hoà tan trong nước, dễ
bị phá huỷ bởi nhiệt độ, nhất là trong môi trường kiềm. Vitamin B1 (dưới dạng muối
Thiamin clohydrat) bị oxy hoá bởi Kali ferixyanua, ở môi trường kiềm cho một chất có
huỳnh quang màu xanh da trời gọi là Thiocrom theo phản ứng sau: Cl-
N CH2 N+ CH3 NaOH N CH2 - N CH3
H3C NH2HCl CH2CH2OH H3C NH2 HO CH2-CH2-OH N S N S
Thiamin clohydrat
Một điểm đặc biệt là khi bị ôxy hoá bởi Kali ferixyanua nó biến thành Thiocrom. Chiết Thiocrom bằng izobutanol và đo huỳnh quang ở huỳnh quang kế. Dùng mẫu trắng để điều chỉnh máy và mẫu có chứa một hàm lượng vitamin B1 hết trước để xác định tỷ lệ
vitamin B1 có thể định lượng được.
Hình 4.3. Huỳnh quang kế (a/Dạng chung; b/ Sơ đồ)
b.Dụng cụ, hoá chất:
- Dụng cụ: Dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. + Huỳnh quang kế. - Hoá chất: + Axít axetic 6%. + NaOH 30%. +Kali ferixyanua 2%. + Dung dịch đệm pH = 4. Axít axetic 6% 5 thể tích. Natri axetat 13,6% 1 thể tích. + Cồn mêtylic.
+ Cồn etylic tuyệt đối.
Hình 4.4. Dạng sơ đồ
+ Izobutanol: thường nó có huỳnh quang phức tạp, ảnh hưởng kết quả phân tích. Nếu huỳnh quang ít không quá 6 vạch trên huỳnh quang kế Jouan (xem hình 4.5) thì không cần tinh khiết hoá lại mà chỉ dùng mẫu trắng có chứa các hoá chất đó có
izobutanol để làm mẫu trắng điều chỉnh máy. Trường hợp huỳnh quang quá nhiều, cần tinh chế lại bằng cách cất phân đoạn: cứ 1 lít izobutanol cho thêm 20g than hoạt tính,
khuấy 15 phút, lắng một ngày đêm, thỉnh thoảng khấy lọc cất phân đoạn lấy thành phần sôi ở 107 – 1080
C.
+ Dung dịch ký ninh sunfat trong axít H2SO4 0,1N (1ml có 1 g ký ninh sunfat). + Dung dịch vitamin B1 tiêu chuẩn: cân 10g vitamin B1 (đã sấy ở 1050C trong 2 giờ) hoà tan vào 100ml gồm 50ml nước cất và 50ml dung dịch đệm pH = 4. Bảo quản trong tủ lạnh.
+ Dung dịch vitamin B1 mẫu (pha khi dùng). Lấy 1ml dung dịch vitamin B1 trên pha với nước cất vừa đủ 100ml.
c. Các bước tiến hành:
Bao gồm 3 giai đoạn:
* Chiết lạnh: lấy 10g nguyên liệu đã sấy, nghiền thành bột; ngân vào 40ml axít axetic 6% trong 48 giờ, sau đem ly tâm 20 phút, tốc độ 40.000 vòng / phút, bỏ cặn lấy dịch chiết.
* Chiết nóng: lấy 5g nguyên liệu, cho vào chến sứ to với 50g cát sạch, nghiền kỹ, cho thêm 100ml nước cất, tiếp tục nghiền. Axít hoá bằng HCl 0, 1N tới pH = 2 – 3. Đun cách thuỷ 600C trong 1 giờ, làm nguội, điều chỉnh pH = 6,5 – 7, 5. Ly tâm, chiết lấy nước, rửa cặn 3 lần với nước. Cho tất cả vào bình định mức, thêm nước và HCl vừa đủ tới thể tích cần và giữ pH không đổi.
Giai đoạn 2: Tinh khiết dịch chiết:
Nếu dịch chiết không có chất keo, lấy 25ml cho vào bình lắng gạn, với 15ml
izobutanol để loại huỳnh quang tạp. Để lắng thành 2 lớp rõ rệt, tách bỏ lớp izobutanol,
lớp dịch chiết đã huỳnh quang tạp dùng để phản ứng Thiocrom.
Nếu dịch chiết có chất keo, dùng dung dịch kẽm axetat trong cồn metylic để phá
huỷ keo (thực phẩm nhiều tinh bột nếp).
Giai đoạn 3: Phản ứng Thiocrom và đo độ huỳnh quang ở huỳnh quang kế. Lấy dịch chiết đã loại huỳnh quang tạp để làm phản ứng: Cho vào 4 ống nghiệm có nút mài các dung dịch theo đếng thứ tự (Bảng 4.4). (Bảng 4.4. Bố trí thí nghiệm) ống A ống B ống C ống D Dịch chiết 4ml 4ml 4ml 4ml Nước cất 1ml 1ml 1ml 1ml Dung dịch mẫu B1 (1ml = 1g) 0 0 0 0 Cồn mêtylic 1ml 1ml 1ml 1ml NaOH 30% 0,5ml 0,5ml 0 0 Dung dịch Kali ferixyanua Nhỏ từng giọt cho chuyển màu vàng rồi + 2 giọt 0 Số giọt bằng ống A Số giọt bằng ống A Nước cất 0 0 0 NaOH 30% 0 0 0,5ml 0,5ml Izobutanol 0 10ml 10ml 10ml
Sau mỗi lần cho dung dịch cần lắc đều. Cuối cùng cho izobutanol xong, lắc 30 phút.
Quay ly tâm các ống B, C, D vài phút, chắt lấy phần izobutanol nếu không trong có thể
thêm cồn etylic (< 1ml).
- ống A để xác định số giọt Kali ferixyanua cần cho vào để ôxy hoá vitamin B1 – lượng cho hơi thừa.
- ống B là ống trắng có huỳnh quang tạp để điều chỉnh máy. - ống C là ống thử, xác định hàm lượng B1 ttrong mẫu thử.
- ống D có thêm 1 lượng B1, để xác định tỷ lệ vitamin B1có thể định lượng được trong mẫu thử.
Đo độ huỳnh quang của 3 ống B, C, D ở huỳnh quang kế.
d. Tính kết quả:
Hàm lượng vitamin B1 trong 100g mẫu thử:
C D B C . độ pha loãng
Trong đó: B - là độ huỳnh quang của ống B biểu thị bằng số vạch trên vòng độ có chia vạch.
C, D - lần lượt là độ huỳnh quang của ống C, D.