a. Nguyên tắc:
Trong sản xuất rượu, thường đánh giá chất lượng của các chế phẩm nấm mốc theo chỉ số: hoạt độ amilaza, maltatza, glucoamilaza, và dextrinaza. ở Việt Nam, chỉ đánh giá theo hệ số Linơ (Lineur). Ta dùng phương pháp đánh giá bằng so màu bằng mắt thường.
b. Dụng cụ, vật liệu, pha dung dịch đệm axetat Natri.
- Hoá chất: Dung dịch axít axetic 1N. Lấy 57,25ml (hoặc 60,12g) axít axetic tinh khiết rồi pha thành 1 lít.
- Dung dịch axetat Natri 1N: Cân 82,08g axetat Natri rồi hoà thành 1l dung dịch. - Dung dịch đệm thu được (pH = 4,7 – 4,8) khi pha 2 dung dịch trên theo tỷ lệ 1: 1. - Dung dịch đệm thu được (pH = 6) khi pha 1 thể tích axít axetic với 16 thể tích axetat Natri.
- Dung dịch tinh bột 1%: cân 1, 1g tinh bột cho vào cốc, cho 25ml nước lạnh, lắc đều sau đó cho thêm 50ml nước nóng ở 500C. Đun cách thuỷ cho tới tan hoàn toàn. Khi nguội cho vào bình định mức 100ml, cho thêm 10ml dung dịch đệm axetat có pH = 4,7 – 4, 8. Đổ đầy nước cất tới ngấn bình.
- Dung dịch iốt: cân 4, 4g KI và 1,4g I2 tinh thể. Cho tất cả vào lọ và cộng thêm 20 – 40ml nước cất, khuấy cho tan và đổ vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới ngấn bình (dùng trong 3 tháng). Dung dịch iốt phân tích, được chuẩn bị từ dung dịch cơ bản trước khi đem dùng. Lấy 20ml dung dịch cơ bản cho vào cốc đã chứa 4, 4g KI hoà tan cho hết, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới ngấn bình.
c. Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch enzim: Cân 5g chế phẩm nấm mốc rồi đem nghiền nhỏ với cát, hoà với 10ml dung dịch đệm và 90ml dung dịch nước. Chuyển vào cốc giữ ở 300C trong 30 phút. Lọc qua giấy; nước trong thu vào cốc khô, dùng để xác định hoạt độ của amilaza. Dùng pipet lấy 25ml dung dịch tinh bột cho vào bình tam giác 100ml. Thêm 20ml nước cất và 5ml dịch men amilaza. Giữ ở 300C, sau 10 phút bắt đầu thử màu với iốt. Làm liên tục tới khi dung dịch thuỷ phân không làm đổi màu của dung dịch iốt (khoảng 10 – 20 phút). Chú ý lượng nước cất cộng với dịch amilaza phải luôn bằng 25ml, còn thể tích dịch thuỷ phân phải bằng 50ml.
d. Tính kết quả:
Hoạt độ amilaza tính theo:
HdA = . 15 . 60 . 25 , 0 a a
ở đây: 0,25 - là lượng tinh bột chứa trong 25ml dung dịch (g).
a - là lượng chế phẩm nấm mốc tương đương với số dịch amilaza đưa vào (g). - là thời gian thuỷ phân (phút).
60 - là hệ số chuyển thành giờ.
2. Phương pháp so màu bằng điện quang sắc kế:
a. Nguyên tắc:
Một đơn vị hoạt độ amilaza biểu thị bằng lượng men có khả năng thuỷ phân 1g tinh bột trong 1 giờ ở điều kiện 300
C, độ pH = 4,7 – 4, 8. Đồng thời phải đảm bảo tỷ lệ giữa enzim và đối chất sau 10 phút, lượng tinh bột được thuỷ phân khoảng 20 – 70%.
b. Dụng cụ, hoá chất:
- Dung dịch amilaza, dịch tinh bột và dung dịch đệm (tương tự phương pháp
trên).
- Dung dịch iốt: cân 0, 25g iốt và 2, 5g KI cho vào cốc 100ml. Tiếp theo cho 5 – 10ml nước cất, khuấy đều và cho vào bình định mức 100ml và 5 – 10ml nước cất khuấy cho tan hết cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho tới ngấn bình. Dung dịch bảo quản chỗ tối.
Trước thí nghiệm, chuẩn bị dung dịch iôt phân tích bằng cách lấy 2ml dung dịch cơ bản, pha thành 100ml. Dung dịch này khi đo trên máy soi màu quang điện phải có mật độ quang học D = 0,160 0,01 (với chiều dày cuvet = 1cm, kính lọc sáng có bước sóng = 453mm).
- Dung dịch HCl 0,1N.
c. Các bước tiến hành.
Cho 10ml dung dịch tinh bột vào mỗi ống nghiệm (2 ống nghiệm cỡ 18x180) khô. Đặt 2 ống vào máy điều nhiệt, giữ ở 300C trong 10 phút. Dùng pipet cho vào ống thứ nhất 5ml nước cất (mẫu kiểm chứng); ống thứ 2 5ml dịch amilaza (mẫu thí nghiệm). Khuấy và giữ 10 phút.
Lấy 1ml mẫu kiểm chứng cho vào ống nghiệm thứ 3 chứa sẵn 10ml HCl 0, 1N. Tương tự, lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm thứ 4 chứa sẵn 10ml HCl 0, 1N nhằm làm ngừng hoạt động của enzim. Giữ 10 phút.
Khuấy đều dung dịch ở ống nghiệm 3 và 4. Mỗi ống lấy 1ml cho vào ống nghiệm 5 và 6 đã chứa sẵn dung dịch iốt phân tích (pipet phải riêng). Lắc đều và đem đo mật độ quang học trên máy soi màu với chiều dài lớp chất lỏng là 1cm, kính lọc sóng có bước sóng = 656 mm.
Mật độ quang học của dung dịch kiểm chứng ứng với lượng tinh bột ban đầu; còn đối với dung dịch thí nghiệm sẽ ứng với lượng tinh bột còn lại sau khi thuỷ phân. Hiệu số giữa 2 giá trị trên ứng với lượng tinh bột đã chịu tác động của amilaza.
d. Tính kết quả:
Lượng tinh bột đã được thuỷ phân:
C = g D D D 1 , 0 . 1 2 1
ở đây: D1 , D2 - là mật độ quang học của dung dịch kiểm chứng và thí nghiệm. 0,1 - là lượng tinh bột chứa trong 10ml dung dịch 1% (g).
Hoạt độ amilaza tính theo: HdA = n C 0,03766 . 254 , 7
Với n là lượng chế phẩm nấm mốc ứng với 5ml dung dịch amilaza (g).