Protein là những hợp chất azốt có phân tử lượng lớn, được tạo thành từ các axít amin,
không tan trong dung dịch axít tricloaxetic 10%.
Protein là thành phần không thể thiếu
của các cơ thể sống của sinh vật. Cùng với axít nucleic, protein giữ vai trò
quyết định và là cơ sở của sự sống.
Protein có những đặc tính không có ở
bất kỳ hợp chất hữu cơ nào như tính đa dạng về mặt cấu trúc, đặc tính loài rất cao, khả năng phản ứng lớn, khả năng thích ứng với môi trường, .vv... Do đó, chính những đặc tính này đảm bảo chức năng “cơ sở của sự sống” của protein.
Lượng protein chứa trong các cơ thể
sống không nhiều và khác nhau. Trong cơ chứa 16 – 23%; gan 18 – 19%. Trong tế bào thực vật, lượng
protein thấp. Trong hạt chứa 10 –
13%; trong lá và thân 1,2 – 3%.
A - Bình phát hơi nước.
B - Bình chứa chất thử đã vô cơ hoá. C - Phễu cho chất thử và hoá chất vào bình.
D - ống sinh hàn.
E - Bình chuẩn độ, hứng NH4OH
G - Hệ thống hút chất thử từ B sau khi cất xong thải ra ngoài.
Trong các protein chứa các nguyên tố C, H, O, N, một lượng nhỏ S và P (C = 50 – 55%; H = 6,5 – 7,3%; O = 21,5 – 23,5%; N = 15 – 18%; S = 0,3 – 2,5%; P = 0,1 – 2%) và một số nguyên tố vi lượng khác.
1. Phương pháp Ken -đan (Kjeldahl)
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần đơn giản mà chính xác.
a. Nguyên tắc:
Vô cơ hoá thực phẩm bằng axít sunfuric đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối amoni sunfat hình thành thể tự do. Định
lượng NH3 bằng 1 axít.
b. Dụng cụ, vật liệu:
- Dụng cụ: Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và bình ken -đan. - Hoá chất: + Axít sunfuric đậm đặc (d = 1,84). + Chất xúc tác có thể dùng một trong các hỗn hợp sau: K2SO4 CuSO4 50g 3,5g K2SO4 100g K2SO4 100g a/ b/ CuSO4 10g c/ CuSO4 10g Seleni bột 1g HgO 10g
Hai loại xúc tác b, c làm vô cơ hoá rất nhanh. Loại c cho hơi độc Hg.
+ NaOH 50% (d= 1,33) không chứa cacbonat.
+ Chỉ thị màu: alizarim Natri sunfat hoặc Tashiro gồm: Dung dịch A: Metyl đỏ 0,1g.
Cồn 900
vừa đủ 100ml. Hoà tan ở nồi cách thuỷ sôi.
Dung dịch B: Dung dịch metyl xanh 1% trong nước 4ml. Cồn 900
vừa đủ 100ml.
Khi dùng, pha 1 thể tích dung dịch A với 1 thể tích dung dịch B. Hỗn hợp chỉ thị màu này có màu xanh lục ở pH > 5,5; chuyển thành tím ở pH < 5,5; chuyển màu xám bẩn ở pH = 5,5.
+ Dung dịch axít boric bão hoà có pH = 5,5.
Axít boric 40g. Nước cất vừa đủ 1.000ml.
Hoà tan 40g axít boric vào 1 lít nước nóng, để nguội cho thêm để đủ 1.000ml.
Điều chỉnh pH 5, 5 bằng NaOH 0,1N (khoảng 13ml) với hỗn hợp chỉ thị màu Tashiro cho tới màu xám bẩn.
+ Dung dịch chuẩn axít sunfuric 0, 1N hoặc HCl 0,1N.
+ Dung dịch hyposunfit tinh khiết (Na2S2O3) hoặc Natri hypophotphit
(NaPO2H2).
c. Các bước tiến hành:
Cân chính xác 1g thực phẩm, cho vào bình ken -đan với: 10ml axít sunfuric đậm đặc
khoảng 5g chất xúc tác.
Để nguyên bình ken -đan trên bếp và đun từ từ. Nếu thực phẩm chứa nhiều nước, đun cho nước bốc hơi và hình thành khói trắng SO3. Khi bọt tan, đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt không màu hoặc màu xanh lơ của CuSO4; để nguội.
Chuyển dung dịch đã vô cơ hoá vào bình cầu máy cất đạm. Rửa bình ken -đan 2 lần với nước cất, nước rửa cho cả vào bình. Trung hoà bằng NaOH 50%, alizarin Natri
sunfonat làm chỉ thị màu, sau đó cho thêm 5ml NaOH 50%. Cất kéo hơi nước và định
lượng trực tiếp NH3 bay sang hoà tan trong bình hứng bằng dung dịch axít sunfuric 0,1N.
d. Tính kết quả: Nitơ toàn phần (g/100g) = 100 . . 0014 , 0 n
ở đây: n - là số mol axít sunfuric 0, 1N dùng chuẩn độ mẫu thử. P - là trọng lượng mẫu thử (g).
2. Định lượng nitơ axit amin bằng phương pháp nitơ focmon (Formol)
a. Nguyên tắc:
Các axit amin trong dung dịch nước thì trung tính, không những do 2 nhóm hoá
chức axít ( - COOH) và amin ( - NH2) trung hoà lẫn nhau, mà do cả 2 nhóm hoá chức đó đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Gặp formol, nhóm amin kết hợp thành nhóm metylenic ( – N=CH2) mất tính kiềm, do đó tính axít của nhóm ( – COOH) nổi bật lên và có thể định lượng bằng một chất kiềm vì phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.
Phản ứng chỉ xảy ra hoàn toàn ở pH = 9,0 – 9, 5. Vì thế khi dùng phenolphtalein làm chỉ thị phải chuẩn dung dịch tới màu đỏ sẫm.
b. Dụng cụ, vật liệu:
- Hoá chất:
+ Formol trung tính, thông thường dung dịch formol bao giờ cũng axít do formol (aldehyt
focmic) bị ôxy hoá bởi không khí thành axít focmic. Do đó khi sử dụng cần trung hoà lại formol bằng NaOH 0, 2N với phenolphtalein làm chất chỉ thị cho tới khi có màu phớt
hồng bền vững.
+ Dung dịch phenolphtalein 1% trong cồn 900.
+ Dung dịch dinatri photphat 0,1N (chứa 17,91g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nước). + Dung dịch NaOH 0,2N.
+ Dung dịch Ba (OH)2 bão hoà trong cồn metylic. + BaCl2 tinh thể.
c. Các bước tiến hành:
Cân chính xác P (g) chất thử đã xay nhuyễn, cho vào bình định mức 100ml, với 50ml nước cất. Lắc mạnh trong 10 phút để hoà tan. Cho thêm 0, 5ml dung dịch
phenolphtalein, khoảng 2g BaCl2 và từng giọt Ba (OH)2 tới màu hồng nhạt. Cho thêm 5ml Ba (OH)2 để kết tủa các muối photphat và cacbonat, cho nước cất vừa đủ 100ml lắc đều và lọc.
Lấy 25ml dịch lọc cho vào bình nón với 20ml dịch lọc formol trung tính. Chuẩn
độ bằng NaOH 0, 2N cho tới màu đỏ tươi (pH = 9,0 – 9,5).
d. Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ formol trong 100g chất thử: Nitơ focmon (g/100g) = 0,0028.n.
100 . 25 100
Hoặc hàm lượng nitơ formol trong 1.000ml chất thử: Nitơ focmon (g/lít) = 0,0028.n. V 1000 . 25 100
ở đây: 0,0028g - là số g nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,2N. n - là số ml NaOH 0, 2N sử dụng.
P, V - là số g hoặc ml chất thử.
Thông thường điểm chuyển màu rất khó nhận, nên dùng dung dịch mẫu để so sánh. Dùng 100ml dung dịch Na2HPO4 0,1N (pH = 9,3) trộn với 0,5ml phenolphtalein 1% có màu đỏ tươi làm mẫu.