C, 5% COR 2 R Sau 24 gi ờ hút bỏ dịch môi trường cũ và cho vào mỗi giếng 1ml EGM-2.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.4. Kết quả định danh tế bào tiền thân nội mô
Các tế bào phát triển phủ khoảng 70% diện tích bề mặt bình nuôi được xử lý Trysin/EDTA 0,25%, tách và thu nhận tế bào sau đó nhuộm tế bào với kháng thể CD14, CD34, CD90, CD133 trong 30 phút, ở 4P
0
P
C. Sau khi phân tích tế bào bằng hệ thống FACS, kết hợp xử lý bằng phần mềm Cell Quest Pro, kết quả được thể hiện trên hình 3.11 và bảng 3.3.
Kết quả xác định EPC bằng phương pháp flow cytometry lần 2, lần 3 xem phụ lục 2, phụ lục 3.
Tế bào được kiểm tra marker CD14, CD34, CD90, CD133qua 3 lần lặp lại được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel (xem phụ lục 4)
Bảng 3.1. Tỷ lệ phần trăm EPCứng viên biểu hiện dương tính với marker khảo sát. Số lần thí nghiệm CD14 (%) CD34 (%) CD90 (%) CD133 (%) Lần 1 0,32 71,35 0,85 64,87 Lần 2 2,41 56,32 2,12 65,08 Lần 3 1,67 45,98 3,21 52,84 Trung bình 1,47 ± 1,06 57,88 ± 12,76 2,06 ± 1,18 60,93 ± 7,01 Từ bảng 3.1 vẽ biểu đổ 3.1
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ phần trăm trung bình EPC ứng viên biểu hiện dương tính với các
marker khảo sát.
Thông qua kết quả ở bảng 3.1 xác định tỷ lệ phần trăm tế bào biểu hiện dương tính và âm tính với từng marker khảo sát (bảng 3.2).
Marker bề mặt Tỷ lệ trung bình tế bào dương tính với marker (%)
Tỷ lệ trung bình tế bào âm tính với marker (%)
CD14 1,47 ± 1,06 98,53 ± 1,06
CD34 57,88 ± 12,76 42,11 ± 12,76
CD90 2,06 ± 1,18 97,94 ± 1,18
CD133 60,93 ± 7,01 39,07 ± 7,01
Quần thể EPC ứng viên có thể gồm EPC, MSC, USSC, CB-MPC. Do sự trùng lấp về marker giữa các tế bào gốc nên phải kết hợp chọn lọc âm tính và dương tính bằng kĩ thuật flow cytometry để chọn lọc chính xác loại tế bào gốc mong muốn. EPC biểu hiện dương tính với CD34, CD133 [36], [56] trong khi đó biểu hiện âm tính với CD90 [1]. Đối với CD14, EPC sớm biểu hiện dương tính [33], [56], EPC muộn biểu hiện âm tính [41]. Các loại MSC, USSC biểu hiện dương tính mạnh với CD90 nhưng biểu hiện âm tính với CB- MPC [1]. Vậy có thể dùng CD90 để loại MSC, USSC; CD14 để loại CB-MPC. Kết quả kiểm tra marker ở bảng 3.4 cho thấy âm tính với CD90 (97,94%) và CD14 (98,53%) nên có thể MSC, USSC, CB-MPC chiếm tỷ lệ thấp trong quần thể EPC ứng viên. Từ đây kết luận rằng trong quần thể EPC ứng viên thì EPC là ứng viên ưu thế nhất.
Kết quả xác định marker của nghiên cứu này khá cao so với kết quả nghiên cứu của Xin Zhang và cộng sự (2008) [63] thu nhận nuôi cấy EPC từ tủy xương chuột, môi trường EGM-2, EPC biểu hiện dương tính với CD34 là 16,5%, với CD133 là 13,9%. Ngoài ra kết quả nghiên cứu không những biểu hiện CD34P
+ P P /CD133P + P mà còn biểu hiện CD14P - Pphù hợp với nghiên cứu của Toshio Imanishi và cộng sự (2008) [56].
Theo Bailey EPC có thể biệt hóa thành các tế bào nội mô, đóng góp vào sự duy trì và sửa chữa mạch máu. Các nghiên cứu khác [11], [26], [42] cũng khẳng định vai trò này của EPC nhưng lại cho rằng chỉ có EPC muộn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo mạch máu mới còn loại EPC sớm có thể sát nhập vào lớp nội mạch nhưng không tham gia trực tiếp hình thành mạch. Tuy nhiên EPC sớm có thể tiết ra các nhân tố tạo mạch kích thích tăng sinh EC, tăng sinh EPC. Không những thế mà khi chết EPC sớm còn tiết ra cytokine tạo mạch. EPC muộn được phát triển từ quần thể CD14P
-
P và được xác định biểu hiện CD34P
+
P
/CD133P
+
P
còn EPC sớm biểu hiện CD14P
+ P P /CD34P + P / CD133P + P
. Như vậy với kết quả kiểm tra marker EPC CD34P + P /CD133P + P /CD14P - P
(CD14 là 1,47%) nên có thể kết luận thêm rằng EPC thu được có EPC muộn là khá cao.
Từ kết quả thu nhận được có thể rút kết luận sau:
Quy trình phân lập EPC từ máu cuống rốn bằng phương pháp nuôi cấy chọn lọc với môi trường EGM-2 sẽ tạo quần thể tế bào tiền thân nội mô tương đối đồng nhất vào lần cấy
chuyền thứ 3 và kết hợp với phương pháp chọn lọc tế bào bằng dòng chảy nguồn EPC được chọn lọc và đã được tinh sạch có thể sử dụng cho mục đích nghiên cứu chuyển gfptiếp theo.