C, 5% COR 2 R Sau 24 gi ờ hút bỏ dịch môi trường cũ và cho vào mỗi giếng 1ml EGM-2.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.3. Nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên
Quần thể tế bào đơn nhân thu nhận được từ phương pháp li tâm trên gradient – Ficoll có thể phân thành ba quần thể tế bào khác nhau: (1) hồng cầu còn sót lại trong mẫu; (2) bạch cầu; (3) tế bào gốc. Các bạch cầu và hồng cầu không bám vào dụng cụ nuôi vì thế khi nuôi các tế bào này trên giá thể cho phép bám dính thì hồng cầu và bạch cầu sẽ bị loại bỏ sau lần thay môi trường đầu tiên. Quần thể tế bào gốc trong máu cuống rốn rất đa dạng gồm nhiều loại tế bào khác nhau như: MSC, HSC, EPC, USSC, CBE, CB-MPC. Nhưng trong đó HSC không có khả năng bám vào bề mặt dụng cụ nuôi, riêng CBE có khả năng bám sau 7 ngày nuôi ở môi trường ưu thế dành cho CBE. Như vậy, sau 48 giờ thay môi trường các tế bào lơ lửng trong dịch nuôi (HSC, CBE) bị loại và quần thể tế bào còn bám lại trong bình nuôi là MSC, EPC, USSC, CB-MPC (hình 3.3).
Hình 3.3. Quần thể tế bào đơn nhân còn lại sau 48 giờ nuôi. (Độ phóng đại 100 lần).
Mẫu có nhiều tế bào bám , (b) Mẫu có ít tế bào bám.
Mỗi loại tế bào gốc có khả năng sống và phát triển trong một môi trường nuôi cấy nhất định, EGM-2 được sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường ưu thế dành cho EPC, do đó các tế bào gốc khác sẽ không phát triển hoặc phát triển yếu và chúng sẽ bị loại dần trong quá trình nuôi cấy.
Sau 7 ngày nuôi cấy các tế bào bám dính bắt đầu tăng sinh và các tế bào này tương đối đồng dạng. Kết quả được thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày (Độ phóng đại 100 lần).
a) Mẫu tế bào bám trải và tăng sinh.
(b) Mẫu tế bào bám ít và không có dấu hiệu tăng sinh.
Sau 12 ngày các tế bào tiền thân nội mô ứng viên tăng sinh mạnh và hình thành colony (hình 3.5).
a
b
.
Hình 3.5. Colony tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 12 ngày (Độ phóng đại 100 lần).
Theo Daniel P. Sieveking và cộng sự, 2008 [11] nghiên cứu phân lập EPC từ quần thể tế bào đơn nhân máu ngoại vi, mật độ nuôi cấy 1 x 10P
7
Ptế bào/ml đến 1,5 x 10P
7
P
tế bào/ml và sử dụng môi trường nuôi EGM-2, kết quả sau 14 – 21 ngày các tế bào tăng sinh mạnh và tạo thành colony EPC dạng hình viên sỏi. Nếu so sánh kết quả nghiên cứu này (1 x 10P
6
P tế
bào/ml) với nghiên cứu của Daniel P. Sieveking thì thời gian tạo thành colony sớm hơn ít nhất 2 ngày và kết quả lại phù hợp với nghiên cứu của David A. Ingram và cộng sự (2004) [14] là EPC thu từ máu cuống rốn có thời gian tăng sinh và phát triển sớm hơn EPC thu từ máu ngoại vi.
Tế bào được tiến hành cấy chuyền (theo tỉ lệ 1: 3) khi quần thể tế bào chiếm khoảng 70 - 80% diện tích bề mặt bình nuôi. Theo dõi kết quả cho thấy thời gian tế bào bám trong nuôi thứ cấp nhanh hơn (12 - 24 giờ đã có tế bào bám – hình 3.6). Các quần thể tế bào cấy chuyền sau 7 ngày có dấu hiệu tăng sinh (hình 3.7; 3.8; 3.9), sau 12 ngày tế bào tăng sinh mạnh và tạo thành colony.
Hình 3.6. Quần thể tế bào bám sau 24 giờ cấy chuyền ở lần 1 (Độ phóng đại 100 lần).
Hình 3.7. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 1 (Độ phóng đại 200 lần).
Hình 3.8. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 2 (Độ phóng đại 200 lần).
Hình 3.9. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 3 (Độ phóng đại 200 lần).
Trong máu cuống rốn EPC chiếm khoảng 10P -6 P – 10P -4 P
[42] nên việc thu nhận EPC phải tiến hành chọn lọc trên nhiều mẫu. Sau khi thay môi trường nhiều tế bào lơ lửng trong mẫu bị loại đi, còn lại một ít tế bào bám vào đáy bình nuôi (10P
3
P
tế bào/ml) nên khả năng tăng sinh của tế bào bám này là rất khó. Mặt khác, nuôi cấy trong môi trường chọn lọc ưu thế dành cho EPC, cho nên nếu các tế bào bám mà không phải là EPC thì khó có khả năng sinh trưởng và sau đó chúng cũng chết dần. Kết quả chọn lọc ứng viên EPC được tổng hợp ở phụ lục 1.