trường nuôi cấy và quan sát hình thái tế bào. EPC muộn có dạng hình viên sỏi trong khi EPC sớm là dạng hình thoi và chúng có thể tạo tập đoàn hoặc mọc rải rác phụ thuộc vào tiềm năng tăng sinh tế bào [14], [22], [37], [47].
- Xác nhận EPC qua sự biểu hiện đương tính, âm tính với các marker CD14, CD90, CD34, CD133. Kết PPquả, số liệu được xử lý bằng phần mềm Cell Quest Pro
2.2.4. Phương pháp flow cytometry [21], [45]
Nguyên tắc: Flow cytometry là kỹ thuật cho phép đếm và phân loại tế bào (hoặc các hạt) dựa trên nguyên lý về tán xạ ánh sáng, kích thích ánh sáng và phát xạ của các phân tử phát huỳnh quang.Trong thiết bị Flow cytometer, các tế bào di chuyển theo dòng chất lỏng ngang qua nguồn sáng kích thích, tia sáng va vào tế bào, chúng sẽ tán xạ hoặc hấp thu và phát ra một ánh sáng tán xạ.
Ánh sáng tán xạ là hệ quả khi một chùm sáng va chạm vào tế bào dẫn đến chúng sẽ phản xạ hoặc khúc xạ đến đầu dò. Ánh sáng này được phân thành hai loại: (1) ánh sáng có góc hợp với tia tới một góc nhỏ hơn 90P
0
P phản ánh kích thước tế bào; (2) ánh sáng có góc hợp với tia tới một góc lớn hơn 90P
0
Ptạo nên bởi độ hạt và mức độ phức tạp bên trong tế bào. Dựa trên thông số thu được khi đo đồng thời hai loại ánh sáng nói trên có thể phân biệt, nhận diện các dạng tế bào trong một quần thể tế bào hổn độn và tính được tỷ lệ phần trăm tương ứng giữa chúng [50].
Qui trình tiến hành [21], [45]:
- Thu tế bào.
- Mẫu tế bào được bỏ dịch nổi và rửa 2 lần PBS.
- Ủ với trypsin/ EDTA 0,25% ở nhiệt độ phòng đến khi tế bào tách ra khỏi bề mặt dụng cụ nuôi (khoảng 3 – 5 phút).
- Ly tâm thu cặn tế bào (3000 vòng/phút, trong 5 phút).
- Ủ, lắc với kháng thể (CD14, CD34, CD90, CD133) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Ủ, lắc trong 15 phút, ở 4P
0
P
C.
- Ly tâm loại bỏ kháng thể thừa bằng dung dịch FACS Flow. - Huyền phù tế bào trong dung dịch FACS Flow.
- Tế bào được đưa vào hệ thống FACS phân tích. - Thu kết quả.
Đánh giá kết quả:
- Phần mềm Cell Quest Pro được dùng để xử lí dữ liệu
- Kết quả phân tích biểu diễn dưới dạng dot blot sử dụng hai thông số để vẽ khung dữ liệu tổng quát trong quá trình phân tích dòng chảy. Mỗi điểm thể hiện sự di chuyển của một tế bào khi nó đi qua đầu dò. Trục X và Y đo các mức độ phát sáng khác nhau, một điểm biểu thị tương ứng với một tế bào có dạng phát sáng khác nhau.
Kết quả phân tích cũng được biểu diễn dưới dạng biểu đồ: trục X biểu diễn tín hiệu thu được, trục Y biểu diễn số lượng tế bào.
- Căn cứ vào tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với các marker sử dụng.
2.2.5. Phương pháp chuyển gen gfp vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector
Lentivirus
Nguyên tắc: Lentivirus có khả năng sát nhập vật liệu di truyền vào nhân của tế bào chủ, vì thế vector Lentivirus được sử dụng để chuyển gen mục tiêu vào nhiễm sắc thể tế bào đích và đảm bảo được tính an toàn cho dòng tế bào chuyển gen vì vector này không có khả năng nhân lên trong tế bào chủ.
Qui trình tiến hành [10], [31]:
- Cấy chuyển EPC trước 24 giờ chuyển nhiễm với mật độ 10P
4
Ptế bào/ml/giếng. - Cho thêm 5 µl CaClR2Rvào giếng 2; 5µl polybrene vào giếng 3.
- Cho 20 µl vector Lentivirus vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 37P
0
P
C, 5% COR2R. - Sau 24 giờ hút bỏ dịch môi trường cũ và cho vào mỗi giếng 1ml EGM-2.