2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu vật – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu Mẫu vật nghiên cứu: Mẫu vật nghiên cứu:
- Máu cuống rốn người thu từ Bệnh viện Phụ Sản Hùng Vương.
- Mẫu máu cuống rốn thu nhận sử dụng cho nghiên cứu: âm tính với HIV, HBV, HCV.
- Thời gian thu mẫu: 08/2010 - 03/2011. - Số lượng mẫu: 37
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí Nghiệm Nghiên Cứu và Ứng Dụng Tế Bào Gốc –
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Thời gian nghiên cứu: Tháng 6/2010 đến tháng 08/2011.
2.1.2. Vector Lentivirus: copGFP Lentivirus được mua từ Công ty Santa Cruz Biotechnology, USA và được sử dụng để biểu hiện gen phát quang màu xanh lá ở tế Biotechnology, USA và được sử dụng để biểu hiện gen phát quang màu xanh lá ở tế bào động vật có vú. So với GFP, copGFP Lentivirus phát quang mạnh và ổn định gấp 1,3 lần.
2.1.3. Hóa chất
2.1.3.1. Dung dịch đệm rửa tế bào PBS pH 7,4
Bảng 2.1. Công thức pha dung dịch PBS.
Thành phần Hàm lượng Cách pha - Bảo quản
NaCl 0,80 g - Cân và khuấy tan lần lượt các thành phần trong 800 ml nước cất 2 lần.
- Bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml - Chuẩn pH 7,4. - Hấp vô trùng ở 121P 0 P C, 30 phút. KCl 0,20 g NaR2RHPOR4R.12HR2RO 0,29 g KHR2RPOR4 0,20 g
Gentamycin 1µl/ml - Bảo quản trong tủ mát 4P 0 P C, sử dụng trong 1 tháng. 2.1.3.2. Dung dịch tách tế bàoTrypsin/EDTA 0,25 %
Bảng 2.2. Công thức pha dung dịch tách tế bào.
Thành phần Hàm lượng Cách pha - Bảo quản
Bột Trypsin (Sigma) 0,250 g
- Cân và khuấy tan lần lượt các thành phần trong 80 ml PBS.
- Bổ sung PBS đủ 100 ml.
- Lọc qua màng lọc vô trùng 0,2 µm. - Bảo quản trong tủ mát 4P
0
P
C, sử dụng trong 3 tuần.
EDTA (Merck) 0,093 g
2.1.3.3. Dung dịch làm giàu tế bào đơn nhân Ficoll-Paque (17-1440-02, Amerstam Pharmacia Biotech) Pharmacia Biotech)
Ficoll- Paque là hỗn hợp ficoll và sodium diatrizoate được dùng để làm giàu tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn .
2.1.3.4. Môi trường ưu thế nuôi EPC từ máu cuống rốn người (Endothelial Cell Growth Medium BulletKit-2) Growth Medium BulletKit-2)
Bảng 2.3. Một số thành phần trong EGM-2. Một số thành phần trong
EGM-2 Tác dụng
hEGF Điều hòa sự phát triển, tăng sinh, biệt hóa tế bào.
hFGF-b Tạo mạch, làm lành vết thương, có vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào.
VEGF Tạo ra mạch máu mới trong quá trình phát triển phôi thai, tái tạo mạch máu sau khi bị tổn thương
Ascrobic Acid (Vitamin C) Kìm hãm sự lão hóa tế bào
Hydrocortisone Kháng viêm
Long R3-IGF-1 Chống thoái hóa tế bào
Heparin Chống đông máu
FBS Cung cấp nhiều thành phần dinh dưỡng cho tế bào, trung hòa các chất độc hại
Gentamicin, Amphotericin Chống nhiễm khuẩn
2.1.3.6. Hóa chất dùng cho kỹ thuật flow cytometry
Dung dịch FACSFlow (BD Biosciences, USA).
Kháng thể đơn dòng kháng CD133, CD34, CD90, CD14 (BD Biosciences, USA).
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.4. Danh sách một số dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm.
STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Bercher (100ml; 50ml) Schott Đức
2 Bình Duran (100ml; 50ml) Schott Đức
3 Bình định mức (1000ml) Schott Đức
5 Erlen (250ml) Schott Đức
6 Eppendorf (2ml) Kartell Pháp
7 Falcon (15ml; 50ml) Corning Hoa kỳ
9 Kim tiêm (10ml) Vikimco Việt Nam
10 Màng lọc 20µm Minisart Hoa kỳ
11 Micropipette (10 - 1000µl) Nichiro Nhật
12 Pipette (10ml, Paster) Schott Đức
14 Roux (25cmP
2
P
) Nunc Đan Mạch
Bảng 2.5. Danh sách các thiết bị sử dụng trong luận văn.
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Máy li tâm Hettich Đức
2 Máy vortex VX100 Labnet Đức
3 Máy khuấy từ Stuart Đức
5 Máy BD FACS Calibur BD BioScience Hoa kỳ
8 Nồi hấp vô trùng Hyrayama Nhật
9 Tủ lạnh Sanyo Nhật
10 Tủ ấm Memmert Anh
12 Tủ cấy vô trùng Telstar Hoa kỳ
13 Buồng thao tác vô trùng Sanyo Nhật
16 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus Nhật
17 Kính hiển vi đảo ngược Olympus Nhật
Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.
(A), (B) hệ thống máy phân tích Flow cytometry; (C) máy ly tâm (D) tủ cấy telstar; (E) hệ thống kính hiển vi huỳnh quang.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu nhận máu cuống rốn người Nguyên tắc: Nguyên tắc:
4T
Máu cuống rốn thu nhận theo qui trình của Ngân hàng máu cuống rốn – Công ty Công nghệ sinh học Canada (Healthcord Cryogenics Corporation).
Qui trình tiến hành:
- Sau khi trẻ được sinh ra và trước khi xổ nhau thai, dùng hai kẹp, kẹp cuống rốn cách trẻ sơ sinh khoảng 20 cm cầm máu và cắt dây rốn (cắt tại vị trí giữa hai kẹp).
- Đặt nhau thai và dây vào khay vô trùng, nhau thai trên bề mặt cao hơn dây rốn. - Khử trùng kim, dây túi máu.
- Đâm kim vào tĩnh mạch dây rốn và thu thập mẫu nhiều càng tốt thông qua dòng chảy trọng lực (tối thiểu là 80 ml). Nhẹ nhàng xoay lắc túi máu để máu pha trộn với thuốc kháng đông máu (CPDA _4Tcitrate-phosphate-dextrose anticoagulant)4T.
- Rút kim ra khỏi cuống rốn, đậy nắp kim. Mẫu máu được cho vào hộp thu mẫu bảo quản ở 4P
0
P
C và chuyển về phòng thí nghiệm.
Đánh giá kết quả: Những mẫu máu được sử dụng để phân lập tế bào tiền thân nội mô không xuất hiện các cục máu đông, thể tích không dưới 80 ml.
2.2.2. Phương pháp li tâm thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người
Nguyên tắc: Việc làm giàu phân đoạn tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn nhằm làm nâng cao khả năng thu nhận quần thể tế bào gốc trong máu cuống rốn. Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma), các tế bào có cùng tỷ trọng nằm cùng một pha.
Qui trình tiến hành [54]:
- Pha loãng máu cuống rốn với PBS với tỉ lệ 1:1. - Hút 5 ml Ficoll-Paque vào ống ly tâm 15 ml.
- Nhẹ nhàng đặt 10 ml hỗn hợp PBS và máu cuống rốn lên trên lớp Ficoll-Paque (1,077 g/ml).
- Li tâm ở 450g trong 20 – 30 phút, ở nhiệt độ 18 – 20P
0
P
C.
- Sau khi li tâm, một lớp tế bào đơn nhân nằm tại lớp giữa, ngay trên lớp mặt của Ficoll-Paque vì chúng có tỷ trọng nhỏ hơn.
- Sử dụng pipette pasteur chuyển lớp giữa chứa MNC vào ống ly tâm mới. - Rửa tế bào với PBS và li tâm ở tốc độ 200g trong 10 phút, ở nhiệt độ 18 – 20P
0
P
C. - Đổ bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào trong PBS và lặp lại hai lần quy trình rửa. - Tái huyền phù tế bào trong một thể tích môi trường EGM-2.
Đánh giá kết quả:Mẫu tế bào đơn nhân thu được tách thành từng tế bào đơn có kích thước các tế bào tương đối đồng nhất và mẫu không lẫn tế bào hồng cầu, tế bào tiểu cầu.
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên từ máu cuống rốn người cuống rốn người
Nguyên tắc: Quần thể tế bào đơn nhân gồm nhiều loại tế bào khác nhau như: MSC, HSC, EPC, USSC, CBE, CB-MPC [44]. Chúng có thể được phân thành hai nhóm tế bào: nhóm tế bào có khả năng bám vào bề mặt của dụng cụ nuôi và nhóm tế bào không có khả năng này. Các tế bào không bám, lơ lửng trong dịch nuôi được loại ra khỏi bình nuôi qua lần đầu tiên thay môi trường. Còn quần thể tế bào bám, tiếp tục nuôi trong môi trường ưu thế dành cho tế bào tiền thân nội mô cho nên hầu hết các tế bào gốc không phải là tế bào tiền thân nội mô khó có khả năng sống và phát triển.
Qui trình tiến hành [35]:
- Lấy 3ml huyền phù tế bào (10P
6
P
tế bào/ml) cho vào bình nuôi 25 cmP
2
P
. - Đặt bình nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37P
0
P
C, 5% COR2.
- Thay môi trường sau mỗi 3 – 5 ngày nuôi cấy.
- Tiến hành cấy chuyền tế bào khi mật độ tế bào trong bình nuôi đạt khoảng 70 – 80% diện tích.
- Quan sát và theo dõi các mẫu nuôi tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược. - Đếm và phân loại tế bào bằng kỹ thuật flow cytometry.
- Thu kết quả.
Đánh giá kết quả: