C. Các nghiên cứu thăm dò về rong, tảo và vi sinh vật biển
d.Động thái sinh tr−ởng và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng nấm sợi T10
T10.6
Nghiên cứu động thái sinh tr−ởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng nấm sợi T10.6 cho thấy, sinh khối khô đạt cao nhất vào ngày thứ 4 (13,24g/l), còn đ−ờng kính vòng kháng khuẩn đạt cao nhất vào ngày thứ 7 (39±2,12). Sau đó, khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy giảm dần. Nh− vậy, từ kết quả nhận đ−ợc cho thấy thời gian dừng lên men thích hợp nhất là sau 7 ngày. Kết quả đ−ợc trình bày trên hình VIII.2.4.b. Sau khi nghiên cứu ảnh h−ởng các điều kiện lên sự sinh tr−ởng và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng nấm sợi T10.6 chúng tôi đã đ−a ra quy trình nuôi cấy thu dịch kháng khuẩn nh− sau.
Nghiên cứu tách chiết hợp chất kháng khuẩn
Đối với việc tách chiết các chất có HTSH từ dịch nuôi cấy hoặc dịch chiết, việc lựa chọn dung môi thích hợp là điều quan trọng nhất. Các dung môi đ−ợc sử dụng phải đáp ứng các tiêu chí sau: (1) không ảnh h−ởng đến hoạt tính kháng khuẩn, (2) có đặc tính bay hơi nhanh ở điều kiện nhiệt độ thấp, (3) phải tách đ−ợc 2 pha rõ rệt. Trong thí nghiệm này, các dung môi đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu là: n-butanol, 2-butanol; n- butyaxetat; etylaxetat, metanol, isopropyl alcohol, clorofom, diclometan.
Vòng vô khuẩn của dịch nuôi cấy chủng T10.6 đối với B.subtilis sau 7 ngày là 37mm. Chúng tôi sử dụng dịch này để tách chất kháng khuẩn với 6 dung môi:n-butanol, 2-butanol; n-butylaxetat; etylaxetat, cloroform, diclometan. Kết quả cho thấy, 6 trong 8 loại dung môi sử dụng có khả năng tách đ−ợc 2 pha rõ rệt. Chỉ có metanol, isopropyl
Chủng nấm sợi T10.6 đó hoạt húa Dịch giống cấp 1, 2 Lắc 200vũng/ phỳt 28-300C 4 ngày
Mụi trường Czapek 1% NaCl, 1%
bột đậu tương, 1% bột ngụ Dịch nuụi cấy chủng T10.6 7 ngày Nuụi tĩnh ở 28-300C Dịch nuụi cấy chứa chất khỏng khuẩn Sinh khnấm sợối T10.6 i chủng Mụi trường Czapek + 1% NaCl
Hỡnh VIII.2.4.b. Quy trỡnh nuụi cấy thu nhận dịch khỏng khuẩn từ chủng nấm sợi biển T10.6
alcohol là không có khả năng tách pha, nên bị loại bỏ. Nhận xét thứ 2 là, sau khi tách chiết bằng 6 dung môi nói trên thì chất kháng khuẩn thô vẫn giữ đ−ợc hoạt tính từ 30- 80% so với hoạt tính ban đầu. Hoạt tính kháng B.subtilis khác nhau đối với từng loại dung môi. Nh−ng theo tiêu chí dung môi phải bay hơi nhanh, tạo 2 pha riêng biệt, không lẫn dịch nuôi cấy, chúng tôi đã chọn dung môi thích hợp là cloroform. Với dung môi này, thời gian tách chiết đ−ợc rút ngắn và hoạt tính kháng khuẫn vẫn giữ đ−ợc khá cao. Sau khi cho bay hơi clorofom bằng máy cô quay, chúng tôi thu đ−ợc dạng bột vàng mịn, mùi hắc. Xác định khả năng kháng khuẩn của kháng sinh thô cho thấy, dung môi clorofom cho hiệu xuất tách chiết khoảng 70%, vòng kháng khuẩn còn 26mm. Từ các kết quả trình bày trên, chúng tôi đ−a ra qui trình tách chiết chất kháng khuẩn từ chủng nấm sợi biển T10.6 (hình VIII.2.4.c).
Hình VIII.2.4.c. Quy trình tách chiết chất kháng khuẩn từ chủng nấm sợi T10.6
VIII.2.5. Định tên khoa học một số chủng VSV biển có hoạt tính sinh học khá cao
Để hiểu biết sâu hơn về các chủng VSV biển có khả năng sinh một số chất có HTSH nh− kể trên, chúng tôi tiến hành định tên khoa học của chúng. Chủng vi khuẩn T9.5 và chủng nấm sợi T10.6 đ−ợc sơ bộ định tên theo hình thái, cơ quan phát sinh bào tử và một số phản ứng sinh hoá. Riêng 3 chủng xạ khuẩn và 3 chủng nấm men đ−ợc định tên theo ph−ơng pháp sinh học phân tử.
Dịch nuôi cấy chủng 10.6
đ∙ tách sinh khối Dung môi Clorofom
Tỷ lệ 1:1 Dung dịch hỗn hợp Nhiệt độ phòng Đảo trộn trong 2h Dung dịch hỗn hợp đ∙ đảo trộn Dung dịch đ∙ tách thành 2 pha Để tĩnh 3h
Dich nuôi cấy sau khi chiết còn lại Hỗn hợp clorofom + chất kháng khuẩn Pha trên Pha d−ới Chất kháng khuẩn thô Clorofom thu hồi
Loại bỏ 500C, 0,53 at Tách pha bằng phễu chiết Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng khuẩn Na2SO410g/l Cô quay 600vòng/phút
Mô tả đặc điểm hình thái, vi học của khuẩn lạc chủng nấm sợi T10.6
Khuẩn lạc trên môi tr−ờng Czapek mọc nhanh, đ−ờng kính 4-5 cm, mầu trắng, mặt dạng xốp bông dày 3 mm ở vùng trung tâm, vùng sát mép khuẩn lạc có mặt dạng nhung, sau 12 ngày có mầu xanh lục do tạo thành bào tử trần. Mặt trái khuẩn lạc có mầu vàng chanh. Không có giọt tiết. Giá bào tử trần nhẵn phát triển từ sợi nấm khí sinh hoặc hiếm hơn từ sợi nền, dài 40-100 àm hoặc 150-250 àm x 1,5-2,0 àm. Th−ờng có 2-3 nhánh ở dọc thân giá hoặc phần ngọn giá. Các nhánh không tạo thành vòng rõ rệt. Nhánh có kích th−ớc 5-20x1,5-2 àm. Ngọn giá hoặc ngọn nhánh mang 1 vòng thể bình 3-8 chiếc, thể bình 6-8x1,5-2 àm, phần đỉnh thon dần, hơi nhọn. Bào tử trần hình cầu, gần cầu 2,5-3
àm, ráp nhẹ. Theo bản mô tả ”A manual of Penicilia”, chủng nấm sợi biển T10.6 có tên khoa học là Penicillium waksmani Zaleski (hình VIII.2.5).
Hình VIII.2.5. Cơ quan phát sinh bào tử (a), hình thái khuẩn lạc chủng nấm sợi biển (b)
Hai chủng nấm sợi TG2, TG3 và chủng xạ khuẩn TG1 phân lập từ trầm tích phá Tam Giang có vòng vô khuẩn kháng nấm và kháng khuẩn khá cao nh−ng chúng tôi ch−a xác định đ−ợc tên khoa học của chúng.
Cả 3 chủng xạ khuẩn mọc tốt trên môi tr−ờng có và không có n−ớc biển. Hình thái khuẩn lạc khá giống nhau, có màu trắng đến nâu trắng, mặt khuẩn lạc khô, bột. Cả 3 chủng đều mọc tốt sau 6-7 ngày nuôi cấy.
Dựa trên cây chủng loại phát sinh có thể nhận thấy, chủng xạ khuẩn VN2 có mối quan hệ gần gũi với loài Streptomyces malayensis (99,78%). Trình tự nucleotids của đoạn 16SrDNA của chủng xạ khuẩn VN2 cho thấy, chủng này có thể thuộc loài
Streptomyces malayensis. Tuy nhiên, khi kiểm tra hoạt tính kháng VSV kiểm định của chủng này thì thấy chúng có hoạt tính kháng vi khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus,
nh−ng theo tài liệu thì loài Streptomyces malayensis không đối kháng với
Staphylococcus aureus. Nh− vậy chủng này cần nghiên cứu thêm về mặt phân loại học, chúng có thể là một loài mới.
Dựa trên cây chủng loại phát sinh, chủng xạ khuẩn VN1 có mối quan hệ gần gũi với loài Streptomyces aurantiogriseus NRRL B-5416 (99,15% nucleotit trùng lặp).
Chủng VN3 trên cây chủng loại phát sinh có mối quan hệ gần gũi với
Streptomyces cheonanensis (99,43%), Streptomyces spinoverrucosus (97,12%). Số liệu 16S rDNA cho thấy loài này có thể là Streptomyces sp. mà có khả năng kháng nấm gây bệnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng nấm men biển TS1 phân lập từ n−ớc biển đảo Tr−ờng Sa đã đ−ợc nghiên cứu về hình thái, nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa, xác định hệ thống Ubiquinone, mol
%(G+C) và phân tích trình tự nucleotit gen 26S rDNA vùng D1/D2. Kết quả đã chỉ ra chủng TS1 có đặc điểm về hình thái, nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa giống với loài Pichia guilliermondii ngoại trừ một số đặc điểm: không lên men Sucrose, Raffinose; không đồng hóa Galactose, Melibiose, Raffinose, Inulin, D-Ribose, Ribitol, 2-Ketogluconic axit; đồng hóa tinh bột tan.
Gen 26S rDNA vùng D1/D2 của chủng nấm men biển TS1 có 560 nucleotit. Trình tự nucleotit này 100% t−ơng đồng với trình tự nucleotit gen 26S rDNA vùng D1/D2 của loài Pichia guilliermondii đã đ−ợc đăng kí trình tự trong ngân hàng gen quốc tế. Do đó có thể kết luận chủng nấm men TS1 thuộc loài Pichia guilliermondii.
Chủng nấm men NT8 (phân lập từ n−ớc biển Nha Trang) dựa theo kết quả phân loại bằng ph−ơng pháp sinh học phân tử, chúng thuộc loài Candida haemulonii
Còn chủng nấm men NT5 phân lập từ n−ớc biển Nha Trang, hiện đang đ−ợc sử dụng để sản xuất chế phẩm "nấm men Phaffia’’ làm chất màu bổ sung thức ăn cho nuôi trồng thủy sản theo các đặc điểm phân loại sinh lý sinh hóa và dựa vào trình tự gen 26S rDNA vùng D1/D2 và cây chủng loại phát sinh cũng cho thấy nó có quan hệ gần nhất với loài P. rhodozyma.
Chủng nấm sợi T10.6 phân lập từ trầm tích biển Quảng Bình thuộc loài
Penicillium waksmani Zaleski.
Chủng vi khuẩn T9.5 phân lập từ trầm tích biển có nhiều đặc điểm thuộc loài
Bacillus sp.
VIII.3. KếT LUậN
1. Đã phân lập và làm sạch đ−ợc 1052 chủng VSV biển từ 81 mẫu n−ớc biển, trầm tích biển và động thực vật biển Việt Nam có độ sâu, độ mặn và khoảng cách xa bờ khác nhau. Trong đó, có 552 chủng vi khuẩn (chiếm 52,5% tổng số chủng), 253 chủng nấm sợi (24%), 157 chủng xạ khuẩn (14,9%) và 90 chủng nấm men (8,6%). Tỉ lệ các chủng VSV biển phân lập từ trầm tích biển có khả năng sinh các chất có HTSH cao hơn so với n−ớc biển. Còn các chủng phân lập từ động thực vật biển hầu nh− không có hoạt tính kháng khuẩn.
2. Đã sàng lọc sơ bộ và thử khả năng kháng 5 chủng VSV kiểm định (vi khuẩn Gram (-):
E.coli; Pseudomonas aeruginose, vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis; Streptococcus..aureus, nấm men gây bệnh: Candida albicans) của 1052 chủng VSV biển. Phổ kháng khuẩn của các chủng VSV thử nghiệm rất hẹp. Không có chủng nào kháng vi khuẩn Gram (-), có 8,1% số chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn gram (+) và kháng nấm, nh−ng chỉ có 1,2% tổng số chủng có hoạt tính cao (vòng vô khuẩn từ 22- 39 mm). Trong 4 nhóm VSV biển phân lập đ−ợc, thì nhóm xạ khuẩn có tỉ lệ số chủng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất (6,8%), tiếp đến là nhóm nấm sợi (9,1%). Nhóm vi khuẩn và nấm men hầu nh− không có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, hoặc có thì rất thấp.
3. Đã thử khả năng diệt sâu hại, gây độc tế bào của 142 chủng VSV biển. Có 5,7% số chủng có khả năng diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh (Heliothis armigera). Có 5,1% số chủng có khả năng gây chết cho giun nhiều tơ Derodigitata Miiler . 4. Đã xác định khả năng sinh các enzim ngoại bào amylaza, xenlulaza và proteaza của
82 chủng VSV biển. Trên 50% số chủng có hoạt tính sinh amilaza và xenlulaza, chỉ có khoảng 12% số chủng có hoạt tính proteaza. Các chủng có hoạt tính enzim ngoại bào phần lớn đều đ−ợc phân lập từ các mẫu n−ớc và trầm tích ven bờ.
5. Đã xác định hàm l−ợng axit béo không bão hoà mạch dài của 6 chủng nấm men biển, hàm l−ợng. Cả 6 chủng đều không sinh DHA (22:6) và chỉ có chủng NT2 sinh EPA (20:5) với hàm l−ợng rất thấp 0,13% tổng số axit béo. Chủng NT1, NT3 và NT8 sinh
Axit linoleic (18:2) cao nhất, từ 28,48-38,55%, còn chủng NT2, TS2 và TS1 sinh Axit linolenic (18;3) khá cao, đạt khoảng 6,55-8,83% axit béo tổng số.
6. Đã tuyển chọn đ−ợc 11 chủng VSV biển có hoạt tính sinh học cao: 3 chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm và gây độc tế bào (VN1, VN2, VN3), 3 chủng nấm men sinh axit béo mạch dài không bão hoà và sinh astaxanthin (TS1, NT8, NT5), 1 chủng vi khuẩn Gram (+) sinh độc tố diệt côn trùng (T9.5) và 4 chủng nấm sợi kháng vi khuẩn Gram (+) (trong đó T10.6 có vòng vô khuẩn rất lớn >45mm). 7. Đã đ−a ra qui trình nuôi cấy và qui trình tách chiết chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy
chủng nấm sợi T10.6.
8. Đã tiến hành định tên một số chủng VSV biển có HTSH cao. Cả 3 chủng xạ khuẩn đều thuộc giống Streptomyces.. Chủng VN1 có tới 99,15% nucleotids trùng lặp với các nucleotids của loài Streptomyces aurantiogriseus NRRL B-5416 ; Còn chủng VN2 có mối quan hệ gần giũ với loài Streptomyces malayensis (99,78%), Còn chủng VN3 trên cây chủng loại phát sinh có mối quan hệ gần giũ với Streptomyces cheonanensis (99,43%). Chủng nấm men TS1 thuộc loài Pichia guilliermondii..
Chủng NT8 thuộc loài Candida haemulonii. Chủng NT5 thuộc loài Phaffia rhodozyma. Chủng nấm sợi T10.6 thuộc chi Penicillium waksman Zaleski. và chủng vi khuẩn T9.5 thuộc chi Bacillus sp.