C. Các nghiên cứu thăm dò về rong, tảo và vi sinh vật biển
VII.2 KếT QUả Và THảO LUậN
VII.2.1.Thu thập và định tên sơ bộ 19 loài Rong tảo biển Việt Nam
Đã thu thập và định tên khoa học đ−ợc 19 loài rong tảo ở một số tỉnh phía Bắc (Hải Phòng), miền trung (Thừa Thiên, Huế) và miền Nam (Nha Trang, Khánh Hoà, Ninh Thuận), Việt Nam. Danh sách các loài đã nêu ở phần trên.
VII.2.2. Hoạt tính của chất kháng viêm đ−ợc chiết từ Undaria pinnatifida bằng các loại dung môi khác nhau
Kết quả phân tích hoạt tính kháng viêm từ Undaria pinnatifida đ−ợc chiết bằng các loại dung môi khác nhau đ−ợc chỉ ra trên bảng VII.2.2.
Bảng VII.2.2. Hoạt tính của dịch chiết kháng viêm đ−ợc chiết từ Undaria pinnatifida bằng các loại dung môi khác nhau
Dung môi Giá trị phù nề Phần trăm ức chế
Giá trị ban đỏ Phần trăm ức chế Acetonitrile 0,03 ± 0,00 96 0,01±0,00 96 Acetone 0,17 ± 0,02 79 0,03 ± 0,00 89 Benzene 0,03 ± 0,00 96 0,04 ± 0,00 85 Chloroform 0,03 ± 0,00 96 * * Cyclohexane 0,13 ± 0,00 84 0,06 ± 0,01 78 Ethyl acetate 0,12 ± 0,00 85 * * Ethyl alcohol 0,27 ± 0,00 67 0,14 ± 0,04 48 Ête 0,12 ± 0,02 85 * * Hexan 0,62 ± 0,02 23 0,10 ± 0,00 63 Metanol 0,12 ± 0,00 85 0,06 ± 0,00 78 Methylene chloride 0,03 ± 0,00 96 * * N−ớc khử trùng 0,70 ± 0,12 14 0,17 ± 0,00 37 N−ớc sôi 0,80 ± 0,00 1 0,16 ± 0,02 4 Đối chứng 0,81 ± 0,04 0 0,27 ±0,01 0
Ghi chú: *: không xác định; Đối chứng: không đ−ợc bôi dịch chiết có hoạt tính kháng viêm. - Mỗi giá trị đại diện trung bình ±S.D. của từ 6 đến 7 con chuột. Sai khác có ý nghĩa thống kê P<0,05
Kết quả trong bảng VII.2.2 cho thấy, hoạt tính kháng viêm trong các dịch chiết từ
U. pinnatifida với các dung môi khác nhau là khác nhau. Hoạt tính kháng viêm cao nhất khi rong đ−ợc chiết với acetonitrile, benzen và metanol. T−ơng ứng với phần trăm ức chế phù nề và ban đỏ trong dịch chiết với acetonitrile là 96% và 96%; trong benzen là 96% và 85%, và trong metanol là 85% và 78%, t−ơng ứng từng giá trị. Tuy nhiên, để tách một l−ợng lớn chất kháng viêm với giá thành rẻ và chất l−ợng tốt để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chọn dung môi để tách chiết là Metanol
VII.2.3. Sàng lọc hoạt tính kháng viêm trong các loài rong biển Việt Nam
Tất cả các loài rong nghiên cứu đều có hoạt tính kháng viêm. Các loài rong biển khác nhau thì hoạt tính kháng viêm cũng khác nhau. Trong đó, Ulva reticulata và
Undaria pinnatifida cho hoạt tính kháng viêm cao nhất (chiếm trên 75% giá trị ức chế phù nề và ban đỏ), sau đó đến các loài Enteromopha linza và Sargassum (S. duplicatum, S. polycystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii, S. binderi) (50-70% giá trị ức chế phù nề và ban đỏ). Hoạt tính kháng viêm thấp nhất là trong các loài Gracilaria arcuata, G. eucheumoides và G. asiatica (nhỏ hơn 20% giá trị ức chế phù nề và ban đỏ).
VII.2.4. ảnh h−ởng của thời gian điều trị viêm bằng dịch chiết từ Undaria pinnatifida lên khả năng kháng viêm ở tai chuột
Sau 0,5 đến 2 giờ điều trị bằng dịch chiết Undaria pinnatifida đều có hoạt tính ức chế ban đỏ. Tuy nhiên, chỉ có phần trăm ức chế ban đỏ trong lô chuột đ−ợc điều trị sau 1h là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê khi so sánh với đối chứng. Phần trăm ức chế phù nề của dịch chiết U. pinnatifidaở các thời gian điều trị khác nhau cũng khác nhau. Khả năng ức chế phù nề của dịch chiết loài nàyđạt cao nhất tại thời điểm sau 1 giờ điều trị (85,63%). Sau thời gian điều trị 2 giờ, khả năng ức chế phù nề và ban đỏ trong dịch chiết này giảm xuống đáng kể. Do đó, chúng tôi chọn thời gian điều trị viêm bằng dịch chiết có hoạt chất kháng viêm từ rong biển cho các thí nghiệm tiếp theo là sau 1 tiếng.
VII.2.5. ảnh h−ởng của các nồng độ dịch chiết trong các loài rong biển nghiên cứu lên khả năng kháng viêm ở tai chuột
Dựa trên kết quả sàng lọc các loài rong có hoạt tính kháng viêm, chúng tôi đã chọn ra một số loài nh− là Undaria pinnatifida, Gracilaria blodgettii, Ulva reticulata,
Sargassum swartzii và S. polycystum để nghiên cứu sâu hơn về ảnh h−ởng của chúng ở các nồng độ dịch chiết khác nhau lên khả năng kháng viêm trên tai chuột.
Kết quả cho thấy phần trăm ức chế của dịch chiết Undaria pinnatifida, Gracilaria blodgettii, Ulva reticulata, Sargassum swartzii và S. polycystum ở các nồng độ khác nhau cũng khác nhau. Trong phần lớn các loài nghiên cứu giá trị này tăng dần theo nồng độ. Khi so sánh dịch chiết thu đ−ợc từ các loài rong nghiên cứu ở nồng độ 0,08ug/ml, chúng tôi thấy rằng dịch chiết của Ulva reticulata và Undairia pinnatifida có hoạt tính kháng viêm cao nhất (thể hiện ở phần trăm giá trị ức chế ban đỏ đạt đến > 80% và ức chế phù nề > 75%). Tiếp theo là hai loài Sargassum swartzii và S. polycystum đ−ợc thu ở ven bờ biển tỉnh Nghệ An và do công ty TNHH Việt Đài cung cấp đều có hoạt tính kháng viêm gần t−ơng đ−ơng nhau (phần trăm giá trị ức chế ban đỏ 58, 83 và 55,25%; ức chế phù nề - 60,14 và 55,06%, t−ơng ứng từng loài một).Còn loài rong câu Thắt - G. blogettii có hoạt tính kháng viêm thấp nhất (26,23 và 6,09%).
Trên cơ sở các số liệu thu đ−ợc ở trên, chúng tôi chọn ra hai loài có hoạt tính kháng viêm cao và trữ l−ợng lớn là Ulva reticulata (thu thập tại Nha Trang, Khánh Hòa) và
Sargassum swartzii để tách chiết l−ợng lớn dịch chiết kháng viêm. Dịch chiết của hai loài này sau đó, đ−ợc sử dụng cho các nghiên cứu sâu hơn về thử hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi sinh vật kiểm định và kháng viêm trên chuột (thử độc tính cấp, tác dụng giảm đau bằng axit acetic, giảm đau mâm nóng, giảm viêm mạn bằng u hạt, gây viêm cấp màng bụng bằng carageenane).
VII.2.6. Kết quả thử hoạt tính vi sinh vật và nấm trên các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Kết quả cho thấy, dịch chiết của loài Ulva reticulata và Sargassum swartzii có hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis (với giá trị IC50 = 62,15 àg/ml) và
Staphylococcus aureus (IC50=56,53 àg/ml), t−ơng ứng từng loài một
VII.2.7. Thử nghiệm độc tính cấp
Sau khi cho chuột uống dịch chiết Sargassum swartzii và Ulva reticulata đến liều cao nhất (66g/kg), chúng tôi thấy rằng chuột sau uống thuốc thử vẫn hoạt động, ăn uống và đi lại bình th−ờng, phân và n−ớc tiểu của chuột không có gì bất th−ờng. Sau 72 giờ, không có chuột nào chết. Vì không thể tăng thể tích theo đ−ờng uống hơn đ−ợc nữa (thể tích thuốc tối đa chuột có thể dung nạp) nên ch−a tính đ−ợc LD50 của cao kháng viêm
Sargassum swartzii và Ulva reticulata trên chuột nhắt trắng theo đ−ờng uống.
VII.2.8. Tác dụng giảm đau
* Theo ph−ơng pháp quặn đau axit acetic (Koster):
Kết quả cho thấy, dịch chiết Sargassum swartzii ở cả 2 liều thấp và cao đều làm giảm rõ rệt số cơn đau của chuột so với lô đối chứng âm ở các thời điểm 5-10’, 10-15’, 15-20’sau khi gây đau cho chuột bằng axit axetic (P<0,05 - 0,001). Liều 500mg/kg có tác dụng tốt hơn và mạnh hơn so với aspirin liều 100mg/kg. Dịch chiết Ulva reticulata ở liều 500mg/kg cũng làm giảm số cơn đau của chuột và t−ơng đ−ơng với Aspirin liều 100mg/kg.
* Theo ph−ơng pháp gây đau bằng mâm nóng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả cho thấy, dịch chiết Sargassum swartzii và Ulva reticulata liều 500mg/kg làm giảm đau rõ rệt thông qua việc làm kéo dài thời gian tác dụng phản ứng với nhiệt độ khi so sánh giữa tr−ớc và sau khi dùng thuốc thử (P < 0,05). Tác dụng của hai dịch chiết này yếu hơn morphin liều 10mg/kg.
VII.2.9. Tác dụng chống viêm cấp
* Trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin:
Kết quả cho thấy, dịch chiết Sargassum swartzii ở cả 2 liều 175mg/kg và 350mg/kg có tác dụng chống viêm rõ rệt thông qua làm giảm thể tích chân chuột gây phù bằng carrageenin ở các thời điểm 2, 6 và 24 giờ (P< 0,05). Tác dụng chống viêm của dịch chiết từ Sargassum swartzii (52,12% ở liều 175mg/kg và 45,84% ở liều 350mg/kg) mạnh hơn khi so sánh với Indometacin liều 25mg/kg (33,145%) ở thời điểm 24 giờ sau gây viêm. Dịch chiết Ulva reticulata không làm giảm viêm cấp tính trên mô hình gây viêm chân chuột bằng carrgeenin (P > 0,05).
* Trên mô hình gây tràn dịch màng bụng
Kết quả cho thấy, dịch chiết từ Sargassum swartzii liều 175mg/kg và liều 350mg/kg làm số l−ợng dịch rỉ viêm giảm rõ rệt so với đối chứng (P <0,05). Trong khi đó Ulva reticulata chỉ có tác dụng ở liều 350mg/kg (P <0,05). Ngoài ra, dịch chiết
Sargassum swartzii và Ulva reticulata ở cả 2 liều không ảnh h−ởng đến hàm l−ợng protein trong dịch rỉ viêm so với lô chứng (P >0,05) và đều có tác dụng làm giảm rõ rệt số l−ợng bạch cầu trong dịch rỉ viêm so với lô đối chứng (P <0,05). Tác dụng giảm số l−ợng bạch cầu trong dịch chiết từ hai loài tảo nghiên cứu có xu h−ớng tốt hơn khi sử dụng Indometacin 25mg/kg.
VII.2.10. Tác dụng chống viêm mạn
Kết quả cho thấy, dịch chiết từ Sargassum swartzii liều 175 và 350mg/kg có tác dụng chống viêm mạn tính thông qua làm giảm trọng l−ợng khối u hạt so với chứng (P <0,05),
tác dụng này có xu h−ớng tốt hơn khi sử dụng Prednisolon liều 5mg/kg. Dịch chiết Ulva reticulata không có tác dụng chống viêm mạn (P >0,05).
VII.2.11. Hàm l−ợng lipit tổng số
- Mẫu S (Cao Sargassum swartzii): 23,69% trọng l−ợng t−ơi - Mẫu U (Cao Ulva reticulata): 19,32% trọng l−ợng t−ơi
Kết quả phân tích trên cho thấy trong hai loại cao thí nghiệm, mẫu cao rong
Sargassum swartzii chứa hàm l−ợng lipit tổng số cao hơn 4,37% so với mẫu cao rong
Ulva reticulata.
VII.2.12.Thành phần axit béo
- Tổng các axit béo no và tổng các acit béo không no của hai mẫu cao rong nghiên cứu có sự khác biệt nhau rõ rệt. ở mẫu S, tổng các acit béo no cao gấp 2,27 lần so với tổng các axit béo không no (60,50% so với 26,65%), trong khi đó ở mẫu U thì ng−ợc lại, tổng các axit béo không no lại cao gấp 1,8 lần tổng các axit béo no (62,70% so với 34,91%). Điều này cũng có nghĩa là tổng các axit béo no của mẫu S cao hơn khoảng 1,73 lần so với mẫu U (60,50% so với 34,91%) còn tổng các axit béo không no thì ng−ợc lại, mẫu U cao gấp khoảng 2,35 lần so với mẫu S (62,70% so với 26,65%).
- Về thành phần axit béo: Mẫu U có hàm l−ợng axit arachidonic (ARA, C20:4(n- 6)) cao gấp 2,74 lần so với mẫu S (1,81% so với 0, 66%). ARA là một loại axit béo thuộc họ Omega-6, tiền chất của các Eicosanoid gây viêm. Vì vậy, kết quả phân tích này có thể là một gợi ý cho việc lựa chọn đối t−ợng tảo biển cho các thí nghiệm thử hoạt tính kháng viêm.
VII.2.13. Kết quả chiết phân lớp
Từ 50 gam cao metanol tổng số chiết xuất từ bột tảo Sargassum swartzii, tiến hành chiết phân lớp bằng các dung môi theo thứ tự là n-hexan, diclometan và etyl-axetat. Sau khi cất đuổi dung môi thu đ−ợc 3 loại cao t−ơng ứng với hàm l−ợng cụ thể là: cao n- hexan chiếm hàm l−ợng cao nhất và cao hơn rất nhiều so với hai loại cao còn lại (74,86% so với 3.80% và 1,60%). Kết quả này có thể cho phép dự đoán trong thành phần hóa học của tảo Sargassum swartzii, hàm l−ợng các chất màu (các sắc tố), các chất béo và các chất ít phân cực nói chung là t−ơng đối lớn.
VII.2.14. Hoạt tính kháng sinh của 3 loại cao tách từ cao metanol tổng số của tảo S
Cả 3 loại cao n-hexan, diclometan và etyl-axetat đều đ−ợc thử sơ bộ hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm xác định xem thành phần có hoạt tính kháng viêm đ−ợc hoà tan trong dung môi nào. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh cho thấy trong 3 mẫu cao đ−ợc thử hoạt tính kháng sinh chỉ có mẫu cao diclometan (Kí hiệu C) có hoạt tính kháng chủng Staphylococcus aureus với giá trị IC50 là 64àg/mL. Giá trị này cho thấy hoạt tính kháng sinh của mẫu thử là t−ơng đối tốt. Điều này cho phép định h−ớng tiếp tục phân tích phần cao này để xác định bản chất hóa học của phần dịch chiết có hoạt tính kháng viêm. Hai loại cao còn lại không thể hiện hoạt tính kháng sinh (hoặc có hoạt tính nh−ng không đáng kể).
VII.2.15. Tinh sạch chất
a/ Phần cao Diclometan:
Tiến hành SKC phần cao Diclometan để tách các phân đoạn, gộp chung các phân đoạn có sắc kí đồ t−ơng tự nhau, chúng tôi thu đ−ợc hai nhóm phân đoạn chính đáng chú ý, kí hiệu là DC1 và DC2 .
- DC1 là nhóm p/đ chứa vết alkaloid dự đoán, đ−ợc hiện d−ới UV ở b−ớc sóng 254 nm, do hàm l−ợng t−ơng đối thấp nên trong thí nghiệm này chúng tôi ch−a kết tinh 254 nm, do hàm l−ợng t−ơng đối thấp nên trong thí nghiệm này chúng tôi ch−a kết tinh và ch−a làm sạch. Quá trình làm sạch sẽ đ−ợc thực hiện trong các thí nghiệm sau.
- Nhóm p/đ DC2 kết tinh cho tinh thể dạng bột, màu trắng, hàm l−ợng khoảng 30 mg (trong tổng số 1,558 gam cao Diclometan đem tách, tức là hàm l−ợng DC2 chiếm gần 2%) . Rửa sạch tinh thể bằng các dung môi thích hợp và kiểm tra độ sạch bằng SKBM. Sắc kí đồ chỉ ra trên hình VIII.3.5.b cho thấy vết chất DC2 hiện rõ d−ới UV ở b−ớc sóng 254nm, có Rf = 0,55 trong hệ triển khai Chloroform : Metanol (9,5:0,5).
Làm khô hoàn toàn tinh thể DC2 và ghi phổ để xác định cấu trúc: + Phổ khối cho peak M = 123
+ Phổ 1H-NMR cho 2 singlet ở δ 3,4 và 3,6 là của hai nhóm CH3 đứng xa nhau, 1 singlet ở δ 7,8 là của CH trong vòng thơm và một tín hiệu ở δ 12,7 là của H liên kết với N.
+ Phổ 13C cho biết hai tín hiệu ở 28,5 và 30,2 là của hai nhóm CH3 liên kết với vòng thơm. Tín hiệu ở 106 là của CH bậc hai trong vòng thơm không bị thế, còn tín hiệu ở δ 140, 149, 151 là của C bậc bốn vòng thơm đã bị thế. Tín hiệu ở 156 là của C trong nhóm acetal –CHO. Từ các tín hiệu của phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR cho thấy phân tử có khối l−ợng 123 gồm các nhóm sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 CH3 (30) 1 CH (13) 1 CH (13) 3 C (36) 1 NH (15) 1 CHO (29) Công thức phân tử: C7H9NO
Dự kiến công thức cấu tạo của phân tử nh− sau:
N H H3C OHC CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 3,5-Dimethyl-4-al-pyrol b) Phần cao n-Hexan
Bằng các ph−ơng pháp sắc ký kết hợp, chúng tôi đã tinh sạch đ−ợc hợp chất HI từ cao n-hexan và đã xác định đ−ợc HI chứa chất 22-Dehydroclerosterol
(www.lipitbank.jp/cgi-bin/detail.cgi)
+ Danh pháp quốc tế: (22E,24S)-24ethylcholesta-5,22,25-trien-3β-ol + Tên thông dụng: 22-dehydroclerosterol
+ Công thức phân tử: C29H46O1
+ Trọng l−ợng phân tử trung bình: 410,675 + Công thức cấu tạo: (Hình VII.2.15) + Nhiệt độ nóng chảy: acetate 146-150oC + Dữ liệu phổ NMR: acetate 1H-NMR (CDCl3) 3-CH=4,601 (m), 3-Ac=2,030 (s), 6- CH=5,370 (br d), 18-CH3= 0,691 (s), 19-CH3=1,012 (s), 21-CH3=1,011(d), 22-CH=5,243(dd), 23- CH=5,171(dd), 24-CH=2,420 (q), 26-CH3=1,646 (d), 27-CH3=4,694 (m), 29-CH3=0,833 (t).
+ Dữ liệu phổ khối MS: acetate: 452[M+] (0,3%), 409(0,2%), 392(100%), 377(3%), 363(3%),
282(5%), 255(32%), 253(12%), 228(3%), 213(7%). Hình VII.2.15. Công thức cấu tạo
VII.2.16. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh và hoạt tính chống oxi hóa của DC2
Sau khi tinh sạch và xác định đ−ợc bản chất hóa học của DC2, chúng tôi đã tiến hành phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính chống oxi hóa của chất này (ở dạng tinh thể).
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh và chống ôxy hóa cho thấy, thấy chất DC2 sau khi đ−ợc làm sạch lại không thể hiện hoạt tính kháng sinh và chống ôxy hóa.
* Có thể lý giải hiện t−ợng chất DC2 ở dạng tinh khiết không có hoạt tính của bởi một số nguyên nhân sau:
- Hoạt tính kháng sinh của phần cao CH2Cl2 có thể không phải chỉ do một chất nhất định gây ra mà là do tác động t−ơng tác của một số chất cùng có mặt trong phần cao này gây ra. Vì vậy khi tách riêng ra, chất DC2 ở dạng tinh sạch không thể hiện hoạt tính.
- Nguyên nhân thứ hai có thể là do tác động của quá trình tinh sạch. Trong quá trình làm sạch DC2, do ảnh h−ởng của dung môi (chứa các chất bảo quản...) nên tinh thể bị bám các chất có nguồn gốc từ dung môi, các chất này làm nhiễu phổ của DC2 nên chúng tôi đã tiếp tục làm sạch để loại bỏ các chất bám này. Có thể do quá trình rửa sạch