VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Các thí nghiệm
3.4.1.1. Thí nghiệm 1.1: Phân lập các chủng VK trên môi trường MRS dựa theo kha năng sinh acid lactic.
a. Mẫu thu thập
- Mắm tơm chua Thái Bình.
- Mắm tơm chua Huế.
- Mắm cà dầm tôm.
b. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS, môi trường MRS dịch thể.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri, ống nghiệm.
c. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng trên môi trường MRS.
- Sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy VK.
- Nhận biết sự có mặt của acid lactic trong dịch ni cấy VK.
3.4.1.2. Thí nghiệm 2.1: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học kh̉n lạc của VK có kha năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đởi kích thước trung bình khuẩn lạc theo thời gian.
- Sự thay đởi hình dạng khuẩn lạc theo thời gian..
- Sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo thời gian..
- Đặc điểm khuẩn lạc theo thời gian.
3.4.1.3. Thí nghiệm 2.2: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học tế bào của VK có kha năng sinh acid lactic được phân lập.
- Nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định Gram của VK.
- Xác định hình dạng, kích thước của VK.
3.4.1.4. Thí nghiệm 2.3: Tìm hiểu hoạt tính catalase của VK có kha năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy khuẩn lạc: môi trường thạch MRS.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian ni cấy t = 48 (h).
- Hóa chất thử hoạt tính catalase: Nước oxy già (H2O2).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bề mặt khuẩn lạc.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng mắt thường.
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng kính hiển vi.
3.4.1.5. Thí nghiệm 2.4: Tìm hiểu kiểu lên men của VK có kha năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH của dịch lên men theo thời gian.
3.4.1.6. Thí nghiệm 2.5: Tìm hiểu hoạt tính protease của VK có kha năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường thử hoạt tính protease.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh protease của VK lactic.
3.4.1.7. Thí nghiệm 2.6: Tìm hiểu kha năng đờng hóa các loại đường của VK sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Đường phục vụ nghiên cứu: glucose, saccharose, maltose, galactose.
- Môi trường ni cấy: mơi trường MRS dịch thể có bở sung thành phần đường khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ống nghiệm.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH dịch lên men theo thời gian.
- Xác định sự tồn tại của acid lactic trong dịch lên men.
3.4.1.8. Thí nghiệm 3.1: Xác định đường cong sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình ni cấy.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đởi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.9. Thí nghiệm 3.2.1: Xác định định tính kha năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS có bở sung CaCO3 0.05 %.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự sinh trưởng của khuẩn lạc của VK theo thời gian đo bằng độ đục OD ở bước sóng 620 nm.
- Sự thay đởi của vịng trịn hoạt tính xung quanh khuẩn lạc theo thời gian.
- Sự biến thiên của bán kính vòng tròn hoạt tính (D – d, mm) theo thời gian.
3.4.1.10. Thí nghiệm 3.2.2: Xác định định lượng kha năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần theo phương pháp trung hòa NaOH.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Lượng (ml) NaOH 0.1 N trung bình đã sử dụng để trung hịa 100 (ml) dung dịch mẫu.
- Lượng acid lactic (g/100 ml mẫu) có trong mẫu.
3.4.1.11. Thí nghiệm 3.3: Xác định kha năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.;
Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
3.4.1.12. Thí nghiệm 3.4: Tìm hiểu anh hưởng của ́u tớ nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình ni cấy.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng bằng đo độ đục trên máy so màu OD620 (bước sóng 620 nm, kính lọc màu đỏ).
3.4.1.13. Thí nghiệm 3.5: Tìm hiểu anh hưởng của nờng độ ḿi đến sự sinh trưởng của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường ni cấy: mơi trường MRS dịch thể có bở sung NaCl ở các nồng độ khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC .
- Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian để xác định khả năng sinh trưởng.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình ni cấy.
b. Chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng
- Sự thay đổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.14. Thí nghiệm 4.1: Tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn đơn lồi của VK lactic phân lập từ mắm tơm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.;
Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Kích thước bán kính vòng tròn kháng khuẩn (D – d, mm) đối với từng chủng.
3.4.1.15. Thí nghiệm 5.1: Tìm hiểu sự thay đởi các giá trị cam quan của mắm tơm chua trong quá trình san x́t ở quy mơ phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo 2 phương pháp: truyền thống và bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 5 ngày / 1 lần kiểm tra.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.1.16. Thí nghiệm 5.2: Tìm hiểu phương pháp làm mắm tơm chua cai tiến trên quy mô phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo phương pháp cải tiến có bở sung dịch ni cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 3 ngày / 1 lần kiểm tra.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.