Thí nghiệm 2.3 Hoạt tính catalase của 2 chủng NB1 và NB5.

24 giờ nuôi cấy

4.2.3. Thí nghiệm 2.3 Hoạt tính catalase của 2 chủng NB1 và NB5.

Trong quá trình quan sát và theo dõi hình thái học khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5, đồng thời tiến hành thử hoạt tính catalase của chúng. Kết quả được phân tích như sau:

 Khi nhỏ 1 giọt nước oxy già (H2O2) lên bề mặt khuẩn lạc VK, chúng tơi quan sát thấy khơng có hiện tượng gì xảy ra (khơng sủi bọt trên bề mặt khuẩn lạc) đối với cả 2 chủng NB1 và NB5. Như vậy:

→ 2 chủng NB1 và NB5 khơng có khả năng phân giải H2O2 (để giải phóng O2), nghĩa là chúng khơng có hoạt tính catalase (-).

→ Điều đó chứng tỏ, 2 chủng NB1 và NB5 là VK kỵ khí.

4.2.4. Thí nghiệm 2.4. Xác định kiểu lên men của 2 chủng nghiên cứu.

Theo kiến thức về 2 kiểu lên men đờng hình và dị hình, ta biết rằng trong quá trình sinh trưởng của VK lên men dị hình có sinh khí CO2 … Điều này là cơ sở tiến hành xác định kiểu lên men của 2 chủng đã phân lập.

Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS (pH 6.5 ± 0.2, to = 30 oC), đặt thêm các ống Dunham vào ống nghiệm và theo dõi quá trình lên men. Quan sát q trình ni cấy thấy:

 Sau 24 giờ nuôi cấy, kiểm tra pH của dịch lên men thấy quỳ tím hóa hờng – đỏ, nghĩa là pH của dịch đạt acid, chứng tỏ đã có sự sinh trưởng của VK và tạo thành acid lactic, làm acid hóa mơi trường.

 Mặt khác, quan sát thấy ống Dunham trong ống nghiệm khơng nởi lên, khơng có bọt khí trong ống Dunham cũng như ở dịch ni cấy, không thấy sủi bọt.

Như vậy, 2 chủng NB1 và NB5 đều sinh trưởng, sinh ra acid làm acid hóa dịch ni cấy, nhưng q trình lên men khơng sinh ra khí (CO2 …). Điều đó giúp chúng tơi sơ bộ kết luận rằng, quá trình lên men của 2 chủng NB1 và NB5 là lên men đờng hình.

Chúng thực hiện lên men đờng hình theo phản ứng sau:

C6H12O6 2 CH3-CHOH-COOH + 94 kcal. (glucose) (acid lactic)

Theo phương pháp thử hoạt tính protease, chúng tôi sử dụng mơi trường có bở sung cơ chất casein. Kết quả cho thấy 2 chủng NB1 và NB5 có hoạt tính protease, nhưng vòng tròn hoạt tính protease (D – d, mm) rất bé, chứng tỏ hoạt tính không mạnh.

4.2.6. Thí nghiệm 2.6. Khả năng đồng hóa các loại đường của 2 chủng NB1 và NB5.

Để tìm hiểu khả năng đờng hóa các loại đường, chúng tơi sử dụng 3 loại đường phục vụ thí nghiệm này là: saccharose, maltose, galactose (bên cạnh glucose đã là thành phần tiêu chuẩn cho môi trường MRS).

Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS lỏng (pH 6.5 ± 0.2, to = 30 oC), thay thế lần lượt đường vào thành phần môi trường MRS với tỷ lệ tương đương, chúng tôi theo dõi và đánh giá các chỉ tiêu cơ bản (pH dịch lên men, sự có mặt của acid lactic) sau 24 giờ ni cấy. Kết quả được phân tích ở bảng như sau:

Bảng 4.3: Khả năng đồng hóa các loại đường của 2 chủng NB1 và NB5 Chủng

Đường

NB1 NB5

pH Acid

lactic pH Acid lactic

Glucose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)

Saccharose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)

Maltose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)

Galactose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)

Chú thích: (+) Tờn tại acid lactic trong dịch ni cấy

Có thể thấy rằng, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng đờng hóa 4 loại đường cơ bản trên, chúng sinh trưởng và sinh ra acid lactic, làm acid hóa mơi trường. Điều này sẽ làm cơ sở khi sản xuất bởi có thể thay đường mía cho glucose.

4.2.7. Sơ bộ định danh cho các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

Tổng hợp các kết quả của các thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra các đặc điểm sinh học của 2 chủng NB1 và NB5 được phân lập từ mắm tôm chua như sau:

Bảng 4.4: Đặc điểm phân loại học 2 chủng NB1 và NB5 Chủng

Đặc điểm NB1 NB5

Gram (+) (+)

Hoạt tính catalase (-) (-)

Mẫn cảm với O2 Kỵ khí Kỵ khí

Khả năng sinh acid lactic (+), không sinh khí (+), không sinh khí

Kiểu lên men Lên men đờng hình Lên men đờng hình

Hình thái tê bào Cầu khuẩn, tạo chuỗi Trực khuẩn, đứng

đơn, xếp đôi

Hoạt tính protease (+), yếu (+), yếu

Khả năng đồng hóa các loại đường:  Glucose  Saccharose  Maltose  Galactose (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Chú thích: (+) Cho kết quả dương tính. (-) Cho kết quả âm tính.

Như vậy, theo khóa phân loại Bergey, chúng tơi sơ bộ xếp 2 chủng NB1 và NB5

là 2 chủng VK lactic, NB1 là loài Streptococcus, NB5 là loài Lactobacillus.

4.3. Kêt quả tìm hiểu một số điêu kiện nuôi cấy VK lactic đã tuyển chọn.

Sau khi tìm hiểu các đặc tính sinh học của 2 chủng VK lactic NB1 và NB5, chúng tơi tiếp tục tìm hiểu về ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của VK lactic, từ đó tìm hiểu q trình tạo thành acid lactic và bacterioxin của chúng.

Như vậy, khía cạnh này được chúng tôi đánh giá ở các nội dung sau:

 Tìm hiểu đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.1).

 Tìm hiểu sự tạo thành acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2).

 Tìm hiểu sự tạo thành bacterioxin của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.3).

 Tìm hiểu sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ mặn) đến sự sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.4; 3.5).

4.3.1. Thí nghiệm 3.1. Xác định đường cong sinh trưởng của VK lactic phân lập tưnguồn mắm tôm chua. nguồn mắm tôm chua.

Xác định đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 giúp ta kiểm soát được q trình ni cấy và xác định được thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu sinh khối. Ngồi ra, ta có thể sơ bộ xác định mối quan hệ giữa quá trình sinh trưởng, phát triển của VK lactic với khả năng sinh acid lactic, khả năng ức chế khuẩn của chúng.

Chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 trên môi trường lỏng MRS, pH 6.5 trong tủ nuôi ổn nhiệt ở nhiệt độ 30 oC. Mẫu được đo OD đến thời điểm 96 giờ sau khi nuôi cấy, cứ 4 giờ nuôi cấy lấy mẫu một lần đo OD, mỗi lần đo được nhắc lại 3 lần. Sau đó, sử dụng phương pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel. Kết quả theo dõi trị số đo OD khi nuôi cấy chủng NB1 và NB5 được thể hiện ở bảng sau: