VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
lý và các bước tiến hành của các phương pháp nghiên cứu VSV nói chung [6], [7], [8]. Các phương pháp cơ bản đó bao gờm:
Phương pháp phân lập VSV.
Phương pháp nuôi cấy và bảo quản VSV.
Phương pháp nhuộm Gram và quan sát đặc điểm hình thái học tế bào VSV. Phương pháp xác định hoạt tính catalase của VSV.
Phương pháp xác định hoạt tính protease của VSV.
Phương pháp xác định khả năng đờng hóa các loại đường của VSV. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của VSV.
Phương pháp thống kê và xử lý số liệu.
Bên cạnh đó, chúng tơi cũng áp dụng những phương pháp nghiên cứu chỉ áp dụng cho VK lactic như sau.
3.4.2.1.Phương pháp nhận biết sự có mặt của acid lactic trong mơi trường.
a. Phương pháp định tính
- Phương pháp sử dụng thuốc thử Uffelmann [6]:
o Điều chế thuốc thử Uffelmann: 20 (ml) H2O + 3 giọt FeCl3 + 3 giọt Phenol đậm đặc.
o Nhỏ dung dịch thuốc thử Uffelmann lên dịch ni cấy. Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng.
- Phương pháp tạo kết tủa đen [7]:
o Acid lactic trong điều kiện có sự hiện diện của acid sunfuric và thuốc tím KMnO4 chuyển thành acetaldehyde. Acetaldehyde khi gặp hỡn hợp Ag/NH3 sẽ có màu đen. Dựa vào sự xuất hiện màu đen, người ta xác định có sự hiện diện của acid lactic trong dịch.
o Cách thực hiện: Lấy 1 ống nghiệm. Cho vào đó 5 – 7 ml dịch lên men. Sau đó cho vào 1 ml H2SO4 rồi đem đun sôi. Cho vào vài giọt KMnO4, đặt vào ống nghiệm 1 tờ giấy lọc (tẩm 10 – 20 ml AgNO3 + 2 ml dung dịch NH4OH). Quan sát hiện tượng.
- Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic trên môi trường MRS bổ sung CaCO3 0.05 %.
6.5 ± 0.2, nhiệt độ 30 oC.
o Theo dõi sự hình thành vòng tròn hoạt tính sinh acid xung quanh khuẩn lạc.
b. Phương pháp định lượng [6]:
- Lượng acid lactic có trong dịch mẫu có thể được biểu diễn bằng độ Therner (To). Độ Therner chính là số ml dung dịch NaOH dùng để trung hịa lượng acid lactic có trong 100 ml dung dịch mẫu. Dung dịch phenolphthalein 1 % trong môi trường acid không màu, khi lượng acid bị trung hịa bởi NaOH thì phenolphthalein chuyển sang màu hờng.
- Cơng thức tính độ Therner: To = n. 100/ V
A % = To x 0.009
Trong đó: n (ml): Lượng NaOH 0.1 N đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. V (ml): thể tích dịch lên men.
To (ml): Lượng NaOH đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. A % (g/100 ml mẫu): Lượng acid lactic trong 100 ml dung dịch mẫu
- Cách thực hiện:
o Cho vào lọ 10 ml dịch lên men, bổ sung H2O cho đủ 100 ml.
o Cho vào mẫu một ít phenolphthalein.
o Dùng NaOH 0.1 N để chuẩn độ đến khí xuất hiện màu hờng bền thì ngừng lại.
3.4.2.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái học khuẩn lạc VK lactic
- Cấy trang dịch pha loãng VK lactic ở nồng độ pha loãng 10-6 trên môi trường thạch MRS, điều kiện nhiệt độ 30 ± 0.2 oC.
- Theo dõi các chỉ tiêu sau ở các thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, sau 72 giờ:
o Khả năng phát triển của khuẩn lạc.
o Màu sắc khuẩn lạc.
o Hình dáng khuẩn lạc.
o Bề mặt khuẩn lạc.
o Kích thước khuẩn lạc.
o Mép khuẩn lạc.
Chủng được nuôi cấy trong ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, trong ống nghiệm đặt úp ngược ống Durham chìm trong dịch mơi trường. Sau 24h ni cấy, nếu có bong bóng khí xuất hiện trong ống Durham có nghĩa là chủng nghiên cứu có sinh khí. Ngược lại khơng có khả năng sinh khí [6].
Những chủng có sinh khí là những chủng lên men lactic dị hình. Những chủng khơng sinh khí có kiểu lên men lactic đờng hình.
3.4.2.4.Phương pháp xác định kha năng sinh bacterioxin của VK lactic
- Chủng cần xác định được nuôi trong môi trường MRS lỏng trong 24h ở 350C. Ly tâm dịch nuôi ở 10000v/ph loại bỏ sinh khối.
- Dịch ly tâm được chuẩn độ về pH trung tính 7.0 bằng dung dịch NaOH 0.1 N.
- Lấy tăm vô khuẩn ngâm trong dịch đã xử lý.
- VSV chỉ thị được cấy trên môi trường thích hợp, đặt tăm thấm dịch vào đĩa, đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 48h.
- Quan sát sự thay đởi và sự hình thành các vùng vơ khuẩn xung quanh tăm.
3.4.2.5. Phương pháp xác định anh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic
- Nuôi cấy các chủng VK lactic trong môi trường MRS dịch thể, pH 6.5 ± 0.2 ở các nhiệt độ khác nhau: 15oC, 20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC.
- Đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm của dịch lên men ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.
3.4.2.6. Phương pháp xác định anh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của VK lactic
- Nuôi cấy các chủng VK lactic trong môi trường MRS dịch thể, pH 6.5 ± 0.2 ở nhiệt độ 30
oC. Bổ sung muối ăn NaCl ở các nồng độ khác nhau 0 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 %.
- Đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm của dịch lên men ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.
3.4.2.7. Phương pháp xác định kha năng kháng khuấn của VK lactic
- Sử dụng phương pháp đục lỗ khuếch tán trên đĩa thạch.
3.4.2.8. Phương pháp đánh giá giá trị cam quan
mắm tôm chua, vị của mắm tôm chua.
PHẦN IV